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yangbin1金蟲 (正式寫手)
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[求助]
crispr/cas9 敲除細菌基因的實驗步驟 已有1人參與
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我想用crispr/cas9系統(tǒng) 敲除或失活大腸桿菌中的一些基因。我現(xiàn)在又pCRISPR和pCAS9兩個質(zhì)粒。 但是我不知道具體的試驗方法。或者大體的步驟也行。 請各位不吝賜教。 |
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2樓2015-03-24 10:30:38
yili_90
金蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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yangbin1: 金幣+5, ★有幫助 2015-03-28 09:34:28
yangbin1: 金幣+5 2015-06-05 16:59:30
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yangbin1: 金幣+5 2015-06-05 16:59:30
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1.設(shè)計基因切除位點（就是設(shè)計sgRNA)�？梢岳肅rispr.mit在線設(shè)計，也可以手動設(shè)計后在NCBI進行blast。 2.將設(shè)計好的”sgRNA+限制性酶切位點“送到測序公司進行合成 3.用限制性內(nèi)切酶切割載體 4.連接，轉(zhuǎn)化，鑒定，測序 5.將對的擴增后進行體外轉(zhuǎn)錄 *如果是動物，則進行胚胎注射。如果是細胞，可以進行電轉(zhuǎn)。如果是細菌，我估計是轉(zhuǎn)化 6.細胞和細菌會要求載體上有篩選標記，如puro。動物不要求。 哎，其實我也不太清楚。不過前期大致應(yīng)該就是這樣。因為最近我在動物身上做crispr/cas9 |
3樓2015-03-24 13:04:10
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