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質(zhì)粒雙酶切后回收效率非常低 已有6人參與
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400bp目的片段連接在Puc57上，載體大小4-5K，體系為50ul，SpeI和AscI各1ul雙酶切，延長(zhǎng)酶切時(shí)間，回收后濃度只有4ng/ul，同時(shí)對(duì)表達(dá)載體（約10K）酶切回收后的濃度為40ng/ul，目的片段這么低的濃度能夠進(jìn)行連接嗎? 如果我把目的片段先擴(kuò)出來(lái)，純化后再雙酶切，這樣會(huì)不會(huì)好一點(diǎn)，只是有一點(diǎn)擔(dān)心的是片段太小，會(huì)不會(huì)回收不到？有做過(guò)400bp片段PCR后雙酶切的嗎？ |
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4樓2015-04-08 03:36:40
2樓2015-04-08 01:00:36
stone2239
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-04-08 09:32:26
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-04-08 09:32:26
| 酶切產(chǎn)物切膠回收后測(cè)濃度時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)濃度較低的現(xiàn)象，這并不一定是回收率低的問(wèn)題，有可能是回收時(shí)，溶液中殘存的瓊脂糖干擾吸光值。建議取2微升跑個(gè)電泳看看，如能看到回收條帶，那做連接應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。即使電泳看不到帶，連接一樣是有可能成功的。你說(shuō)的先把片段擴(kuò)出來(lái)，純化后再雙酶切，當(dāng)然也是可以的，400bp做酶切完全沒(méi)有問(wèn)題，關(guān)鍵是你的擴(kuò)增產(chǎn)物酶切位點(diǎn)兩側(cè)是否加了保護(hù)堿基，如果沒(méi)加，會(huì)影響酶切效率，甚至可能切不開(kāi)。 |
3樓2015-04-08 02:01:42
5樓2015-04-08 03:41:02
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