juan_819

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[求助] 本人分子生物小白一枚，剛剛開始做pcr，目前在擴(kuò)cDNA的全長(zhǎng) 。。。已有4人參與

我已經(jīng)設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物。第一對(duì)做的不太成功。第二對(duì)今天早上做了一下可以擴(kuò)出來一些。在1500bp附近有我需要的目的基因，但是我用早上的產(chǎn)物做二次擴(kuò)增的時(shí)候卻怎么也做不出來了。只有引物二聚體。想問一下，如果改用LAtaq酶會(huì)不會(huì)效果好一些，在引物、鎂離子等濃度上有什么需要注意的地方，希望各位指點(diǎn)一下，謝謝。

上午做梯度的結(jié)果

本人分子生物小白一枚，剛剛開始做pcr，目前在擴(kuò)cDNA的全長(zhǎng) 。。。-1

用第四第五管做二次pcr的結(jié)果

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1樓 2015-04-15 16:44:41

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-04-15 22:06:12

有引物二聚體可以嘗試提高一下退火溫度，目的條帶暗可以增加循環(huán)數(shù)，至于說用pcr產(chǎn)物做模板繼續(xù)pcr一般是需要稀釋產(chǎn)物之后再做二次pcr。

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2樓2015-04-15 16:54:05

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-04-15 22:06:29

兩次都是引物加太多了，一輪PCR出來目的片段就很少，大部分都是二聚體，用這個(gè)做模板沒有條帶也正常。
建議一輪PCR重做，減少引物量。

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3樓2015-04-15 16:56:39

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2樓: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 16:54:05
有引物二聚體可以嘗試提高一下退火溫度，目的條帶暗可以增加循環(huán)數(shù)，至于說用pcr產(chǎn)物做模板繼續(xù)pcr一般是需要稀釋產(chǎn)物之后再做二次pcr。

我已經(jīng)用40個(gè)循環(huán)了，還可以在繼續(xù)加么

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4樓2015-04-15 17:08:57

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3樓: Originally posted by wjasaa at 2015-04-15 16:56:39
兩次都是引物加太多了，一輪PCR出來目的片段就很少，大部分都是二聚體，用這個(gè)做模板沒有條帶也正常。
建議一輪PCR重做，減少引物量。

我現(xiàn)在用的體系是50μl
ddH2O27.75μl
Buffer 5μl
Mg2+ 4μl
dNTP 4μl
引物F 2μl
R 2μl
rTaq 0.25μl
DNA5μl
請(qǐng)問哪里需要改進(jìn)的謝謝啦

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5樓2015-04-15 17:15:45

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4樓: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 17:08:57
我已經(jīng)用40個(gè)循環(huán)了，還可以在繼續(xù)加么...

增加第一輪PCR用的模板量或減低模板的稀釋倍數(shù)。要做第二輪PCR之前可以用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化一下第一輪的PCR產(chǎn)物來去掉引物二聚體后再稀釋來作為模板。

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6樓2015-04-15 17:51:55

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5樓: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 17:15:45
我現(xiàn)在用的體系是50μl
ddH2O27.75μl
Buffer 5μl
Mg2+ 4μl
dNTP 4μl
引物F 2μl
R 2μl
rTaq 0.25μl
DNA5μl
請(qǐng)問哪里需要改進(jìn)的謝謝啦...

我用的體系是50μl
ddH2O 36.5μl
Buffer（Mg2+ plus） 5μl
dNTP (2.5mmol/L) 4μl
引物F(10μmol/L) 1μl
   R 1μl
rTaq (5U/μl)    0.5μl
cDNA    2μl
我用的Buffer里有鎂離子 cDNA一般用的是提的RNA反轉(zhuǎn)稀釋10倍后作為模板

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7樓2015-04-15 18:00:57

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6樓: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 17:51:55
增加第一輪PCR用的模板量或減低模板的稀釋倍數(shù)。要做第二輪PCR之前可以用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化一下第一輪的PCR產(chǎn)物來去掉引物二聚體后再稀釋來作為模板。...

我們實(shí)驗(yàn)室目前還沒有做過pcr產(chǎn)物回收請(qǐng)問你所說的PCR產(chǎn)物純化試劑盒是膠回收還是直接拿pcr產(chǎn)物就可以做了

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8樓2015-04-15 18:58:46

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7樓: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 18:00:57
我用的體系是50μl
ddH2O 36.5μl
Buffer（Mg2+ plus） 5μl
dNTP (2.5mmol/L) 4μl
引物F(10μmol/L) 1μl
   R 1μl
rTaq (5U/μl)    0.5μl
cDNA    2μl
我用的Buffer里有鎂離子 cD ...

稀釋的話是用雙蒸水嗎我用的是師姐之前做ITS2的條件所以很多地方還需要在摸索一下。我再改改吧 LAtaq可以用么

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9樓2015-04-15 19:00:25

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8樓: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 18:58:46
我們實(shí)驗(yàn)室目前還沒有做過pcr產(chǎn)物回收請(qǐng)問你所說的PCR產(chǎn)物純化試劑盒是膠回收還是直接拿pcr產(chǎn)物就可以做了...

實(shí)驗(yàn)室用的是生工的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，因?yàn)橐锒垠w片段很小所以可以去掉，直接用PCR產(chǎn)物就行。

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10樓2015-04-15 19:42:51

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