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[求助] 直接用DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR可行嗎？已有3人參與

作為剛接觸分子生物的小白，老板也不太了解熒光定量PCR,只是給出任務(wù)說要用類似的方法檢測土壤中產(chǎn)CA功能菌及CA表達(dá)的變化情況。因?yàn)橥寥乐刑崛NA難度太高，所以放棄了檢測CA表達(dá)量的變化，在看了相關(guān)文獻(xiàn)后，看到有人說可以直接提取宏基因組，然后以特定功能基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR之后制作質(zhì)粒，通過和標(biāo)準(zhǔn)品CT值的對比可以得出功能菌的豐度變化情況，請問可行嗎？

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1樓 2014-09-08 16:22:20

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biot

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完全可行，你要提取盡量高質(zhì)量的DNA，設(shè)計好引物，構(gòu)建好質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，最后可計算出拷貝數(shù)

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2樓2014-09-08 19:58:38

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2樓: Originally posted by biot at 2014-09-08 19:58:38
完全可行，你要提取盡量高質(zhì)量的DNA，設(shè)計好引物，構(gòu)建好質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，最后可計算出拷貝數(shù)

謝謝！如果可能的話有沒有相關(guān)的文獻(xiàn)推薦？麻煩了

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3樓2014-09-09 09:14:36

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xipha

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用DNA的話, 測該菌的量是可以的. 如果你的CA(不知道是什么)是蛋白或者功能蛋白產(chǎn)物,用DNA是無法得到表達(dá)量變化的.

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4樓2014-09-09 09:29:27

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4樓: Originally posted by xipha at 2014-09-09 09:29:27
用DNA的話, 測該菌的量是可以的. 如果你的CA(不知道是什么)是蛋白或者功能蛋白產(chǎn)物,用DNA是無法得到表達(dá)量變化的.

CA是碳酸酐酶，老板的意思是既然酶的表達(dá)量測定不出來，就想驗(yàn)證下產(chǎn)CA的典型菌的豐度和溶蝕量是不是成正比，目前是在研究一株從當(dāng)?shù)赝寥乐泻Y選出來的細(xì)菌，想著設(shè)計引物對CA基因進(jìn)行PCR后制作質(zhì)粒，通過和標(biāo)準(zhǔn)品曲線的比對得出這種細(xì)菌含量隨季節(jié)的變化，應(yīng)該是可行的吧？

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5樓2014-09-09 16:15:02

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a314919473

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這個很簡單：絕對定量
1. 測量300mg土壤，提取DNA。
2. 設(shè)計CA（猜測是產(chǎn)甲烷桿菌），的引物，PCR
3. 克隆并測序：將PCR產(chǎn)物電泳，純化，TA克隆，得到質(zhì)粒，進(jìn)行拷貝數(shù)換算。
4. qPCR檢測，得到具體拷貝數(shù)（換算成XX拷貝數(shù)/mg土壤）

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6樓2014-09-09 16:19:06

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xipha

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5樓: Originally posted by 糾結(jié)的面包 at 2014-09-09 16:15:02
CA是碳酸酐酶，老板的意思是既然酶的表達(dá)量測定不出來，就想驗(yàn)證下產(chǎn)CA的典型菌的豐度和溶蝕量是不是成正比，目前是在研究一株從當(dāng)?shù)赝寥乐泻Y選出來的細(xì)菌，想著設(shè)計引物對CA基因進(jìn)行PCR后制作質(zhì)粒，通過和標(biāo)準(zhǔn)品曲 ...

這個事沒問題的. 酶的表達(dá)量沒辦法測酶活或者做westernblot么?

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7樓2014-09-10 08:41:54

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