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Cindycclove新蟲 (小有名氣)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)問題 已有2人參與
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請(qǐng)教一下各位師兄師姐，我要擴(kuò)增一段基因，在gene bank里查詢到mRNA長(zhǎng)度為3590bp，CDS從61到3028bp，我需要設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物包含該基因所有片段，那么，我設(shè)計(jì)的時(shí)候是不是只能從61bp和3028bp處開始尋找較好的引物呢？這樣的話引物幾乎固定了，選擇的范圍就很小了，只能是增加減少堿基的區(qū)別，設(shè)計(jì)出來的引物很多found，怎么辦呢？ 如果從CDS序列中間尋找較好的引物，只能擴(kuò)出其中的一部分，我需要做該基因的克隆、原核表達(dá)及免疫效果，只用其中一部分是不是沒有說服力，必須擴(kuò)增出全部呢？ 另外在5‘端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，用不用考慮對(duì)引物TM值的影響呢？加入酶切位點(diǎn)以后，5’端還需要保護(hù)堿基嗎（酶切位點(diǎn)分別是BamHI、EcoRI） 剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的小白，請(qǐng)各位大神不吝賜教，小妹一定虛心接受批評(píng)建議。跪謝。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-07 22:05:51
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1.最好擴(kuò)完整編碼區(qū)。 2.可在61前和3028后設(shè)計(jì)引物，先擴(kuò)出來包含完整編碼框的片段連到克隆載體上，然后以載體為模板，再設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)從起始密碼子到終止密碼子的編碼區(qū)。 3.加酶切位點(diǎn)引物計(jì)算Tm時(shí)不需考慮增加的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基序列。 4.如果是要直接酶切PCR產(chǎn)物，要加保護(hù)堿基；如果含酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物連T載后酶切，則可以不加保護(hù)堿基。 |
2樓2015-05-07 19:38:04
Cindycclove
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3樓2015-05-08 11:47:14
★ ★ ★
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-05-08 22:24:28
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-05-08 22:24:28
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1.cDNA是包含5‘UTR區(qū)和3'UTR區(qū)的。 2.直接在61和3028處設(shè)計(jì)引物的話，可能找不到合適的引物，就像你說的有很多fund，這樣會(huì)影響擴(kuò)增效率；另外，這一步PCR時(shí)用的模板是cDNA，是各種cDNA的混合物，模板復(fù)雜，易錯(cuò)配，也會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果。綜上，這樣直接設(shè)計(jì)引物擴(kuò)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)不出或擴(kuò)出非目標(biāo)帶的問題，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法繼續(xù)。先設(shè)計(jì)特異性好、擴(kuò)增效率高的引物把序列得到，連到載體上，以載體為模板，再以61和3028處的引物去擴(kuò)，這樣因?yàn)槟０迨菃我坏模词挂锊皇呛芎线m，仍能得到高效擴(kuò)增。 3.3000是長(zhǎng)，但也不是不能擴(kuò)，所以更要按我說的方法擴(kuò)。有全長(zhǎng)就不用做RACE了，或者你可以用重疊PCR試試，把你的3000多序列分兩次擴(kuò)，然后再擴(kuò)全長(zhǎng)。 |
4樓2015-05-08 13:09:14
Cindycclove
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5樓2015-05-08 17:59:14
6樓2015-05-08 19:09:56
mataomatao
禁蟲 (正式寫手)
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7樓2015-05-09 09:15:15
mataomatao
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8樓2015-05-09 09:17:08
9樓2015-05-09 13:00:55
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