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xynlwt新蟲(chóng) (初入文壇)
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SSR預(yù)實(shí)驗(yàn)熒光帶不上 已有2人參與
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| 如題，SSR的預(yù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)做了很久，熒光基團(tuán)總是加不到目的片段上，而是加在二聚體或者其他雜帶上，20ul和10ul體系都能P出來(lái)，用的酶是天根的TAQ MIX，引物部分試過(guò)三種都失敗了，其他水和DNA的比例問(wèn)題不大。1），F(xiàn)引物：M13F引物：修飾基團(tuán)：R引物=2：3：5：10。2），F(xiàn)引物：M13F引物：修飾基團(tuán)：R引物=0.5:0.5:9:10。這種熒光加在目的片段上一點(diǎn)點(diǎn)，峰極低，幾乎看不見(jiàn)。3），用了兩輪，第一輪，M13F引物：R=1:1。第一輪產(chǎn)物用作第二輪模板，第二輪引物比例為，修飾基團(tuán)：R引物=1:1。峰還是很低，要么就是依然加在比較短的雜帶上。最后想看看正常情況到底應(yīng)該什么樣，就合了一條直接把修飾基團(tuán)加在F引物上的引物，這次確實(shí)加到了目的片段上，但是這種方法太貴了，預(yù)實(shí)驗(yàn)的話(huà)會(huì)遠(yuǎn)超預(yù)算，只有預(yù)實(shí)驗(yàn)先做好了正式實(shí)驗(yàn)再用，所以請(qǐng)大神們幫我看看怎樣能把這個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)部分做出來(lái)，謝了！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 這個(gè)效果肯定沒(méi)有直接標(biāo)記在引物上好，我們?cè)囘^(guò)引物合成的時(shí)候合成長(zhǎng)一點(diǎn)的引物，也就是一端（F或R)的引物在其5‘端加上M13引物，第一次PCR就用這個(gè)擴(kuò)增，然后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用熒光標(biāo)記的M13引物和另一端沒(méi)有標(biāo)記的（R或F）引物，再擴(kuò)增一次。效果還行。 |
3樓2015-05-11 20:16:12
xynlwt
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2樓2015-05-11 15:05:53
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4樓2015-05-11 21:43:21
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5樓2015-05-12 14:13:14
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