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1576127095新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
基因敲除中的一次同源重組問(wèn)題 已有1人參與
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一次同源重組總是重組不上，請(qǐng)大俠賜教一下一次同源重組的注意事項(xiàng)，做不出來(lái)很著急 |
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RuyangHan
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2樓2015-05-14 10:52:42
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3樓2015-05-14 14:32:37
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【答案】應(yīng)助回帖
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我猜你就是這個(gè)問(wèn)題，你是用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，然后用PCR篩選嗎？ 我是10個(gè)中9個(gè)假陽(yáng)性，1個(gè)二次重組突變。你也可能都是假陽(yáng)性，這是沒(méi)辦法控制的。也有可能沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)，PCR檢出的假陽(yáng)性的條帶要是很弱，就應(yīng)該注意是不是背景污染，其實(shí)是真的陽(yáng)性。 假如你不愿意多篩，還可以試試下面兩種方法： 1. 把你的重組質(zhì)粒切開(kāi)成鏈狀，這樣直鏈DNA片段轉(zhuǎn)化到菌體中，單交換是致死的，沒(méi)有菌落，獲得的菌落都是陽(yáng)性。問(wèn)題是大的質(zhì)粒切開(kāi)后很長(zhǎng)，使轉(zhuǎn)化效率很低。 2. 把質(zhì)粒中的左右兩邊同源和抗性基因這一段用PCR擴(kuò)增出來(lái)，大概3-4K，不太長(zhǎng)了，用這個(gè)片段來(lái)做轉(zhuǎn)化，得到的菌落也是只有突變陽(yáng)性的。 |
4樓2015-05-15 08:28:54
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