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圣主魂新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR擴(kuò)出來的片段短怎么辦？ 已有5人參與
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| PCR擴(kuò)出來的片段比學(xué)哥以前做的2100bp短（大約短200bp），引物稍微把內(nèi)切酶改動了下，體系用過學(xué)哥的也是沒擴(kuò)出來。94°：5min;94°：30s，60°：30s；72°：3min;72°：10min；34個(gè)循環(huán)。一直在做這個(gè)悲催的PCR,,,,,求解脫......... |
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1、退火溫度不僅僅是看引物的tm值，整體的GC含量也很重要，樓主可以把溫度稍微提高一點(diǎn)，包括變性的溫度， 2、延伸時(shí)間越長確實(shí)擴(kuò)的越長，但是樓主的基因只有2000bp左右，3min確實(shí)太長了 3、循環(huán)數(shù)越多越容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增 4、時(shí)間太長酶也失活了，其中可能有相當(dāng)一段時(shí)間相當(dāng)于空跑，浪費(fèi)了很多時(shí)間，除非中途加酶， |
8樓2015-05-26 07:57:39
paul_j
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2015-05-26 11:23:53
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PCR擴(kuò)出來的片段比學(xué)哥以前做的2100bp短（大約短200bp）,這個(gè)片段基本上是對的，小200bp是正常的。 引物只換了內(nèi)切酶的話，退火溫度不用換，內(nèi)切酶的堿基我基本是不計(jì)算進(jìn)退火溫度的，35個(gè)循環(huán)很好。延伸基本是一分鐘1000bp，整體上你學(xué)哥的條件沒問題。把你小200bp的片段送去測序看看，有條件的話，連個(gè)T載體，好測通。 |
10樓2015-05-26 11:07:25
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