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michacel1217銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
蛋白純化-離子交換咨詢(xún) 已有1人參與
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現(xiàn)在在做一個(gè)蛋白的純化與分離，進(jìn)過(guò)酶切之后，需要將酶與切下的片段去除，這兩個(gè)蛋白的PI在5.0左右，而我的目的蛋白PI在7.0左右。 現(xiàn)打算將蛋白溶液PH調(diào)制6.0，先使用陰離子交換劑掛雜蛋白，收集目的蛋白，再調(diào)PH至5.0，使用陽(yáng)離子交換劑濃縮我的目的蛋白，打算使用PB緩沖液，不知該方法是否可行，敬請(qǐng)指點(diǎn)！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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對(duì)于大多數(shù)的分離純化蛋白質(zhì)步驟，建議剛開(kāi)始就是用強(qiáng)離子交換柱，可以在摸索方法的過(guò)程中有一個(gè)寬的pH范圍。對(duì)于一個(gè)已知等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，可根據(jù)其等電點(diǎn)來(lái)選擇離子交換劑（離子交換劑是連接在介質(zhì)上的功能基團(tuán)，也可以指離子交換介質(zhì)本身）。如果用陰離子交換劑，使用緩沖溶液的pH值應(yīng)該高于該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)該緩沖溶液中帶有凈負(fù)電荷，可以與交換層析柱上的陰離子交換劑發(fā)生靜電結(jié)合。如果選用陽(yáng)離子交換劑，緩沖溶液的pH應(yīng)低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)在該緩沖溶液中攜帶凈正電荷，可與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合。 在考慮離子交換劑（離子交換功能基團(tuán)）的強(qiáng)弱時(shí)，如果目的蛋白質(zhì)很穩(wěn)定，應(yīng)首先選用強(qiáng)交換介質(zhì)，強(qiáng)交換介質(zhì)的動(dòng)力載量不會(huì)隨pH值的不同而改變，離子交換過(guò)程遵循最基本的吸附原理。所謂的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，一般可從其耐受的酸堿性、離子強(qiáng)度、溫度范圍這幾個(gè)角度考慮，考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定的極限是防止蛋白質(zhì)變性，而不是發(fā)生蛋白質(zhì)共價(jià)修飾，甚至降解。用各種層析柱分離提純蛋白質(zhì)時(shí)，一般不是常溫，就是低溫，所以通常不必考慮溫度對(duì)于需要層析的目的蛋白質(zhì)的影響，但是蛋白質(zhì)的酸堿性和離子強(qiáng)度的耐受性則必須要考慮。這點(diǎn)是很多蛋白質(zhì)分離提純的新手所容易忽略的。 使用強(qiáng)離子交換介質(zhì)允許較大的吸附pH及離子交換強(qiáng)度選擇范圍，目的分子吸附后只需要提高緩沖的鹽濃度即可洗脫，同時(shí)可有目的分子的濃縮效應(yīng)。而若離子交換介質(zhì)pH適用范圍較小，在pH小于6時(shí)，弱陽(yáng)離子交換介質(zhì)失去點(diǎn)和，而在pH大于9時(shí)，弱陰離子交換介質(zhì)失去電荷。所以，一般情況下，在分離等電點(diǎn)pH 6-9的目的蛋白質(zhì)，尤其是當(dāng)目的蛋白質(zhì)分子不穩(wěn)定時(shí)，需要較溫和的色譜條件才會(huì)選用弱交換介質(zhì)。對(duì)于未知的蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換層析柱分離提純時(shí)，也建議首先使用弱交換介質(zhì)。 結(jié)合樓主的具體情況，陽(yáng)離子用PB溶液當(dāng)然可以醋酸鹽、檸檬酸、甘氨酸等也可以。陰離子交換層析不能用PB緩沖溶液，要用Tris、乙二胺、咪唑等。其實(shí)緩沖溶液的濃度異地要低，甚至可以低于10mmol/L，洗脫時(shí)盡量用梯度洗脫。兩個(gè)蛋白的pI在5.0左右，現(xiàn)打算將蛋白溶液pH調(diào)制6.0，這時(shí)雜蛋白質(zhì)帶有凈負(fù)電荷，而你的目的蛋白質(zhì)帶有凈正電荷，此時(shí)使用陰離子交換劑當(dāng)然會(huì)掛上負(fù)電荷的雜蛋白，能夠收集目的蛋白。而后把蛋白質(zhì)緩沖溶液再調(diào)PH至5.0，可以直接用PB作為緩沖溶液，此時(shí)目的蛋白質(zhì)帶有凈正電荷，那么可用陽(yáng)離子交換柱分離出目的蛋白質(zhì)，洗脫時(shí)可以恒定PB的濃度，但是加大NaCl溶液的濃度。 |
2樓2015-06-11 17:15:14
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【答案】應(yīng)助回帖
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第二段更正（原文有些錯(cuò)別字）： 結(jié)合樓主的具體情況，陽(yáng)離子用PB溶液當(dāng)然可以，也可用醋酸鹽、檸檬酸、甘氨酸等也可以。陰離子交換層析不能用PB緩沖溶液，要用Tris、烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等。起始緩沖溶液的濃度應(yīng)該盡量低要低，甚至可以低于10mmol/L，洗脫時(shí)盡量用梯度洗脫。兩個(gè)蛋白的pI在5.0左右，現(xiàn)打算將蛋白溶液pH調(diào)制6.0，這時(shí)雜蛋白質(zhì)帶有凈負(fù)電荷，而你的目的蛋白質(zhì)帶有凈正電荷，此時(shí)使用陰離子交換劑當(dāng)然會(huì)掛上負(fù)電荷的雜蛋白，能夠收集目的蛋白。而后把蛋白質(zhì)緩沖溶液再調(diào)PH至5.0，可以直接用PB作為緩沖溶液，此時(shí)目的蛋白質(zhì)帶有凈正電荷，那么可用陽(yáng)離子交換柱分離出目的蛋白質(zhì)，洗脫時(shí)可以恒定PB的濃度，但是加大NaCl溶液的濃度。 |
3樓2015-06-11 17:19:59
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michacel1217: 金幣+100, ★★★★★最佳答案 2015-06-13 20:32:12
michacel1217: 金幣+100, ★★★★★最佳答案 2015-06-13 20:32:12
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對(duì)于你的第一次處理的蛋白質(zhì)（pI=5.0而言），使用pH6.0 的平衡緩沖液可以平衡陰離子交換柱，平衡緩沖液需要約10個(gè)柱體積，直到pH和電導(dǎo)率監(jiān)控與平衡緩沖溶液的pH和電導(dǎo)率一樣為止，而且測(cè)試曲線要平穩(wěn)。 |
6樓2015-06-12 09:25:43
7樓2015-07-07 21:53:10
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