Daniel_佳

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最近想用重疊PCR的方法，融合3個(gè)片段，大小分別為480,823,465，是三個(gè)同時(shí)融合容易還是先兩個(gè)融再上第三個(gè)。第一輪的三個(gè)片段都已經(jīng)得到，后面要做幾輪PCR比較好，而且體系怎么加比較合適，用的是PrimeStar Max高保真酶P的。求高手能夠詳細(xì)指點(diǎn)，這只是第一步，后面還要連載體。多謝多謝�。。。。�

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1樓 2015-06-29 22:34:54

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fuyuandj86

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Daniel_佳(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-30 13:16:29

三段一起裝省時(shí)間，每個(gè)片段互相延伸進(jìn)旁邊的片段20bp, 也就是說(shuō)有40bp重合，然后三個(gè)片段混合在一起跑10-15個(gè)循環(huán)。然后暫停PCR, 加入一對(duì)引物，正反引物要結(jié)合在拼接后片段最兩端的位置。再跑25-30個(gè)循環(huán)。

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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.

4樓2015-06-29 23:46:28

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啥都不用說(shuō)，三個(gè)片段放一起，然后兩頭引物直接p

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10樓2015-06-30 20:15:23

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Daniel_佳(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-30 13:16:37

15bp也能夠，3個(gè)片段取差不多相同量，直接用最外邊兩個(gè)引物，片段A的正向引物，和片段C的反向引物，直接pcr

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6樓2015-06-30 10:16:01

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Tama二等兵

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這么小，三段一起裝，或者拼個(gè)全長(zhǎng)也是可以的啊

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2樓2015-06-29 22:50:56

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2樓: Originally posted by Tama二等兵 at 2015-06-29 22:50:56
這么小，三段一起裝，或者拼個(gè)全長(zhǎng)也是可以的啊

謝謝您的回復(fù)，您能說(shuō)的詳細(xì)些嗎？

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3樓2015-06-29 23:11:21

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4樓: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起裝省時(shí)間，每個(gè)片段互相延伸進(jìn)旁邊的片段20bp, 也就是說(shuō)有40bp重合，然后三個(gè)片段混合在一起跑10-15個(gè)循環(huán)。然后暫停PCR, 加入一對(duì)引物，正反引物要結(jié)合在拼接后片段最兩端的位置。再跑25-30個(gè)循環(huán)。

如果只有15bp重合，能做嗎？

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5樓2015-06-30 09:14:38

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用E-fusion融合酶，直接做鏈接反應(yīng)，效力超高。http://www.biophay.com/showpro.asp?id=16&Classid=1僅供參考。

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7樓2015-06-30 15:10:55

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正解，

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8樓2015-06-30 18:38:38

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