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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
哪位戰(zhàn)友能幫我設計一下RACE用的GSP引物嗎 已有2人參與
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打算做race，試劑盒也買好了，但是在設計GSP上遇到了問題，在oligo7上單獨搜索上游引物或下游引物失�。ㄏ薅嗽诒Ｊ貐^(qū)內），按對搜索的時候能成功，但問題是本應該在靠近5‘端設計3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端設計5’race用的reverse GSP primer，按對搜索的時候就反過來了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看說明書上說引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5個堿基中G或C不得多于2個，但是我設計的沒有一條能達到要求�，F(xiàn)附上序列，請高手幫幫忙吧，感激不盡！ GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC 這條序列的兩個保守氨基酸序列分別為TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后對應原核苷酸序列為1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后對應原核苷酸序列為577-353），說了也奇怪，我再ORF上搜索的時候明明是第一條氨基酸保守區(qū)在上游，第二條氨基酸保守區(qū)在下游，可不知道為什么，blastx后卻發(fā)現(xiàn)，第一個保守區(qū)變到下游去了，而且NCBI上給的序列還是反的，是1966-1655和577-353，按道理不應該是從小到大嗎？ 所以我有3個問題：1、為什么應該在上游的保守序列跑到了下游？2、這個序列編號為什么是從大到��？3、就是RACE的引物設計問題了。 附上我自設計的引物 GSP - RACE.png |
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餓的神啊
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6樓2015-07-08 09:18:41
2樓2015-07-06 11:25:20
餓的神啊
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3樓2015-07-07 08:47:18
【答案】應助回帖
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按照RACE試劑盒手冊進行��！我們用SMART race試劑盒。 用降落pcr+巢氏pcr進行擴增。 長度：20~28bp，我一般選22~25bp, 產物長度：至少100bp（3‘和5’ 重疊區(qū)） 引物可以用DNAman進行擴增效率檢測；用NCBI primer-blast進行特異性驗證。 要是還不清楚，認真看看Primer3的使用手冊。 http://primer3.ut.ee/ or http://www.simgene.com/Primer3 |
4樓2015-07-07 11:37:24
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