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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
哪位戰(zhàn)友能幫我設(shè)計(jì)一下RACE用的GSP引物嗎 已有2人參與
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打算做race，試劑盒也買好了，但是在設(shè)計(jì)GSP上遇到了問(wèn)題，在oligo7上單獨(dú)搜索上游引物或下游引物失�。ㄏ薅嗽诒Ｊ貐^(qū)內(nèi)），按對(duì)搜索的時(shí)候能成功，但問(wèn)題是本應(yīng)該在靠近5‘端設(shè)計(jì)3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端設(shè)計(jì)5’race用的reverse GSP primer，按對(duì)搜索的時(shí)候就反過(guò)來(lái)了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看說(shuō)明書上說(shuō)引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5個(gè)堿基中G或C不得多于2個(gè)，但是我設(shè)計(jì)的沒(méi)有一條能達(dá)到要求�，F(xiàn)附上序列，請(qǐng)高手幫幫忙吧，感激不盡！ GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC 這條序列的兩個(gè)保守氨基酸序列分別為TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后對(duì)應(yīng)原核苷酸序列為1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后對(duì)應(yīng)原核苷酸序列為577-353），說(shuō)了也奇怪，我再ORF上搜索的時(shí)候明明是第一條氨基酸保守區(qū)在上游，第二條氨基酸保守區(qū)在下游，可不知道為什么，blastx后卻發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)保守區(qū)變到下游去了，而且NCBI上給的序列還是反的，是1966-1655和577-353，按道理不應(yīng)該是從小到大嗎？ 所以我有3個(gè)問(wèn)題：1、為什么應(yīng)該在上游的保守序列跑到了下游？2、這個(gè)序列編號(hào)為什么是從大到��？3、就是RACE的引物設(shè)計(jì)問(wèn)題了。 附上我自設(shè)計(jì)的引物 GSP - RACE.png |
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2樓2015-07-06 11:25:20
餓的神啊
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3樓2015-07-07 08:47:18
【答案】應(yīng)助回帖
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按照RACE試劑盒手冊(cè)進(jìn)行啊！我們用SMART race試劑盒。 用降落pcr+巢氏pcr進(jìn)行擴(kuò)增。 長(zhǎng)度：20~28bp，我一般選22~25bp, 產(chǎn)物長(zhǎng)度：至少100bp（3‘和5’ 重疊區(qū)） 引物可以用DNAman進(jìn)行擴(kuò)增效率檢測(cè)；用NCBI primer-blast進(jìn)行特異性驗(yàn)證。 要是還不清楚，認(rèn)真看看Primer3的使用手冊(cè)。 http://primer3.ut.ee/ or http://www.simgene.com/Primer3 |
4樓2015-07-07 11:37:24
erland21411
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5樓2015-07-07 16:57:11
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6樓2015-07-08 09:18:41
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7樓2015-07-08 09:24:10
8樓2015-07-08 17:38:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
餓的神啊: 金幣+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
餓的神啊: 金幣+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
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對(duì)。正是這樣。最好上游和下游各設(shè)計(jì)2條， 如： F100, F200 R400, R600 巢氏pcr—— for3‘：第一輪 F100+UMP，第二輪F200+NUP for5'：第一輪 R600+UPM，第二輪R400+NUP 說(shuō)明幾點(diǎn)： (1)UPM、NUP序列是公開(kāi)的，直接去公司合成； pcr所用 taq酶，我們用的是extaq，效果較穩(wěn)定；全氏金公司的transtaq我么也試過(guò)，也可以。 (2)不要忘記cdna合成，反轉(zhuǎn)錄的效率要保證。我們用BD kit提供的，單獨(dú)買千元上下。你也可以買國(guó)產(chǎn)的，我們用百泰克的也能做出來(lái)。 |
9樓2015-07-08 17:47:40
erland21411
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10樓2015-07-08 21:13:40
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