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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
哪位戰(zhàn)友能幫我設(shè)計一下RACE用的GSP引物嗎 已有2人參與
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打算做race，試劑盒也買好了，但是在設(shè)計GSP上遇到了問題，在oligo7上單獨搜索上游引物或下游引物失�。ㄏ薅嗽诒Ｊ貐^(qū)內(nèi)），按對搜索的時候能成功，但問題是本應(yīng)該在靠近5‘端設(shè)計3’race用的forward GSP primer，在靠近3‘端設(shè)計5’race用的reverse GSP primer，按對搜索的時候就反過來了，上游引物在5‘端，下游引物在3’端。而且我看說明書上說引物3‘端的GC含量要低，3’端最末的5個堿基中G或C不得多于2個，但是我設(shè)計的沒有一條能達(dá)到要求�，F(xiàn)附上序列，請高手幫幫忙吧，感激不盡！ GCCCTTTTATGCCTTTGAACCACTCGAATGAACCTTGTTCCCTTGTCACCCAATAGAAGTATGCTTTTCTTGTATTGAATGATGAATTCTTGTTGTTGTTGTTTACTGTTAATCCTGACTCTAAATTGTTGTCTTCTGATTTCATGTTGTTGATGATGTCTTTGACTATGCTGATCATGGGAGTAGCCCCAATTCCAAGCCCCACTAGTAGCACTACATCATATTTTTTATAGTCTTGAGCTGGTGCTCCATATGGTCCGTCTATTAATATCTTTGGAAACCCTCGAGAGTTATTTTCCCTTTCTGCTCTAAGAAGACCGCTCTTCCCAGCAGGTGCAGGCTGGCAAACCTCAGAGAAAACTGTCTTAAGCTGCCTAGTCCAATCGCCCAAAGTTCGGATATGAACGCTGAGGTAGTCATCTCCTGGTGATGATGTGATGGAAAACGGATGCCATTCGAACGGTGAGACGGCAGCGCAATTTACGAACATGTACTGTCCGCTCTTGTATTTGAAGCCTTGTGGTTTTGACATGTGTAATGCCAAGGCATTTCCAGGATAAACAGCAACCTTGAGAATCTTGACAGGCTCGATGCTTGATCTCAAAGCTCTAGTCAATCTCTCACAAGCATAAAGAACCATCGGGACAGCCAGATACATCCATGTCGTCTTCTGATACCATTTCTTGGTGAGATAGAGTTTAATTCCATGGACAATGAGAGGGGTATAGACAATGATGAAAAGATGATGTGAGTACCAAAAGGCATTGAATCCAGTGAGTCTTTTAAGTGGTTTTGGCAGATTGAGCTTGTTGCGCCTGAACCAAGGCGTTGCCAAAGTGAATGCTATCACCATTAACACCACCATTATGATCCCTGTTACTCCTTCAACTCCCTTTACAAACCACCAGTAATTATCCGGTTGCTCGTCCCCAAAGTAAGGCTTCATTGGCTCGTATTCTTCTTCAGTCGCGTGGAGGAGTCGCGGGAAATCACAGGTTAGATGAGCTCCGCCGTGTAATATAACTCCAATCCCAATTCCAACCGCGATCACCTTATGGAAATTTAAGTTGTCATCGAAAGGGACAACAAGTCCTAATTTAGTTTTGTTTCTGAGCCATGTGATGGTGTTTCGGCAAACTGGTAATAATATCAAGGCCATGTTGAATTTAAGTGTCTCTGCTCCTCCTTTAGCAATGCAAACGCAATAGCCCATCACATCATAAGCAGCCTTGTTTCGGTACTGCACAAACTTGTAGGCAAATAAACCCCCGACAATTCCAAGCCACAACAGCATAATCCAAACCCTTTGCCAATTATCCATCAAAAAGTACTTAATCTTCTGATAACATTTTCGTAATGGGTTGTTTTCTTGGGTTGGCTTCAGCTTCTGGCTCAACATTTGACTCAGAATTCGACTGTCTCCTACTCTTACAGATTGATTTGGAGCTTGCAACAACAATGTTTCCAGGTTATGAATCATGATGTATCCGGCATTGTCAGGGTCTAATTCTTCCATAATCATGGCTGCATATTCCTCTGCTTGTTTCTGAATGTTGGAGAGCTTGTTTGCAGAAGCACTCAGACTAATAATCTCTTTGACTTCTTCTTCAGTGATTCTTCCATCAGCGTCTGTGTCGACCATGTCAAAGAAAGTTTGGAGCCTGGAGTCAAAGCTCTCGTCGGAAATCTGGTCCCAAAACTCCTTGAGCTGAGCTTTGTTGATAGAGTCACCACTTATATTATGCTTTCTACAAAGTCCTCGGAATAGCTCACCCGCAAATTCTTTAGACTCCTTGTTCATCCCTATGCATTCGCCGAACATCGAGCAATGAAGAAGGCCGTCGGAGGTCGTGATGGCGAGCTCGTTATACCGCTTCTCGACGGCAGGCCAGCCATTTCCGGCAGCTCCCGTCTTGGTGGTGATGAACTTGAGTCCTTTAAGAGCATGAGCTGCAGCGGATTTAGTCCTATCAAAACGCCTGCTGCTGGGTCGCCGTGTCAAGGAAGCAAAGCGTTTGAGCTCTTGAGAGACCTGCTTGATATGCGAGGAAGTGAAGGGC 這條序列的兩個保守氨基酸序列分別為TKSAAAHALKGLKFITTKTGAAGNGWPAVEKRY NELAITTSDGLLHCSMFGECIGMNKESKEFAGELFRGLCRKHNISGDSINKAQLKEFWDQ ISDESFDS（blastx后對應(yīng)原核苷酸序列為1966-1655）和ILKVAVYPGNALALHMSKPQGFKYKSGQYMFVNCAAVSPFEWHPFSITSSPGDDYLSVHI RTLGDWTRQLKTVFS（blastx后對應(yīng)原核苷酸序列為577-353），說了也奇怪，我再ORF上搜索的時候明明是第一條氨基酸保守區(qū)在上游，第二條氨基酸保守區(qū)在下游，可不知道為什么，blastx后卻發(fā)現(xiàn)，第一個保守區(qū)變到下游去了，而且NCBI上給的序列還是反的，是1966-1655和577-353，按道理不應(yīng)該是從小到大嗎？ 所以我有3個問題：1、為什么應(yīng)該在上游的保守序列跑到了下游？2、這個序列編號為什么是從大到��？3、就是RACE的引物設(shè)計問題了。 附上我自設(shè)計的引物 GSP - RACE.png |
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【答案】應(yīng)助回帖
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餓的神啊: 金幣+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
餓的神啊: 金幣+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-09 09:10:46
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對。正是這樣。最好上游和下游各設(shè)計2條， 如： F100, F200 R400, R600 巢氏pcr—— for3‘：第一輪 F100+UMP，第二輪F200+NUP for5'：第一輪 R600+UPM，第二輪R400+NUP 說明幾點： (1)UPM、NUP序列是公開的，直接去公司合成； pcr所用 taq酶，我們用的是extaq，效果較穩(wěn)定；全氏金公司的transtaq我么也試過，也可以。 (2)不要忘記cdna合成，反轉(zhuǎn)錄的效率要保證。我們用BD kit提供的，單獨買千元上下。你也可以買國產(chǎn)的，我們用百泰克的也能做出來。 |
9樓2015-07-08 17:47:40
2樓2015-07-06 11:25:20
餓的神啊
新蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 5982.7
- 散金: 122
- 帖子: 1004
- 在線: 66.3小時
- 蟲號: 2477988
- 注冊: 2013-05-23
- 性別: MM
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
3樓2015-07-07 08:47:18
【答案】應(yīng)助回帖
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按照RACE試劑盒手冊進行啊！我們用SMART race試劑盒。 用降落pcr+巢氏pcr進行擴增。 長度：20~28bp，我一般選22~25bp, 產(chǎn)物長度：至少100bp（3‘和5’ 重疊區(qū)） 引物可以用DNAman進行擴增效率檢測；用NCBI primer-blast進行特異性驗證。 要是還不清楚，認(rèn)真看看Primer3的使用手冊。 http://primer3.ut.ee/ or http://www.simgene.com/Primer3 |
4樓2015-07-07 11:37:24
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