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下面是我的電泳圖紅框里是我的問(wèn)題條帶基因原長(zhǎng)是2900BP左右
PCR模板是連了T載體的質(zhì)粒
酶切是可以獲得目的基因的就是紅框后面的酶切條帶
但是pCR得不到目的條帶
我重新提取了野生型的DNA 也沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶
我用的酶有primier start 普通TAQ也沒(méi)有。。。
求解�。。。。。。。。。。。。。�1

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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-07-10 21:06:29

你說(shuō)的問(wèn)題條帶是什么意思？是你的目的條帶嗎？2900bp也不算長(zhǎng)啊，引物模板退火溫度都是要考慮的，質(zhì)粒作為模板擴(kuò)增也很常見(jiàn)，應(yīng)該不會(huì)有問(wèn)題吧（你自己看看）引物也得你自己驗(yàn)證了，，可以使用hot start taq酶擴(kuò)增試試看，改用熱啟動(dòng)PCR的方法，高保真酶可能會(huì)讓模板降解吧

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2樓2015-07-10 10:11:44

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2樓: Originally posted by 18761615793 at 2015-07-10 10:11:44
你說(shuō)的問(wèn)題條帶是什么意思？是你的目的條帶嗎？2900bp也不算長(zhǎng)啊，引物模板退火溫度都是要考慮的，質(zhì)粒作為模板擴(kuò)增也很常見(jiàn)，應(yīng)該不會(huì)有問(wèn)題吧（你自己看看）引物也得你自己驗(yàn)證了，，可以使用hot start taq酶擴(kuò)增 ...

我的問(wèn)題是我做了PCR 但是條帶看上去不是質(zhì)粒嗎就像質(zhì)粒自己跑的電泳沒(méi)有經(jīng)過(guò)PCR

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3樓2015-07-10 10:52:45

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3樓: Originally posted by xianglixie3 at 2015-07-10 10:52:45
我的問(wèn)題是我做了PCR 但是條帶看上去不是質(zhì)粒嗎就像質(zhì)粒自己跑的電泳沒(méi)有經(jīng)過(guò)PCR...

。。。什么問(wèn)題，我竟無(wú)言以對(duì)

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4樓2015-07-10 10:54:44

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4樓: Originally posted by 18761615793 at 2015-07-10 10:54:44
。。。什么問(wèn)題，我竟無(wú)言以對(duì)...

就是理論上來(lái)說(shuō)我用紅色框框框出來(lái)的帶應(yīng)該在 2900 但是事實(shí)上它不在
而且這個(gè)帶看上起很大而且像是直接用質(zhì)粒跑電泳出現(xiàn)的條帶

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5樓2015-07-10 11:54:54

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-07-12 23:18:45

把你的模板質(zhì)粒稀釋下作為模板再PCR擴(kuò)增下試試看。

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突破自我，喜迎曙光

6樓2015-07-10 16:22:27

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引用回帖:

5樓: Originally posted by xianglixie3 at 2015-07-10 11:54:54
就是理論上來(lái)說(shuō)我用紅色框框框出來(lái)的帶應(yīng)該在 2900 但是事實(shí)上它不在
而且這個(gè)帶看上起很大而且像是直接用質(zhì)粒跑電泳出現(xiàn)的條帶...

樓主你想多了，那怎么可能是質(zhì)粒直接跑的電泳，你設(shè)計(jì)引物是干嘛的，能跑出整個(gè)，那只是非特異性條帶而已。。。。

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7樓2015-07-10 17:00:24

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-07-12 23:19:03

樓主啊，問(wèn)題我看了好久才看懂，下次上圖的時(shí)候別把整張圖都放上來(lái)。

據(jù)我分析，你質(zhì)粒模板是加多了，引物還沒(méi)經(jīng)過(guò)三個(gè)循環(huán)就差不多用完了。仔細(xì)考慮下pcr前三個(gè)循環(huán)，相信你能懂的。

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初來(lái)乍到，請(qǐng)多指教

8樓2015-07-10 23:11:05

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8樓: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-10 23:11:05
樓主啊，問(wèn)題我看了好久才看懂，下次上圖的時(shí)候別把整張圖都放上來(lái)。

據(jù)我分析，你質(zhì)粒模板是加多了，引物還沒(méi)經(jīng)過(guò)三個(gè)循環(huán)就差不多用完了。仔細(xì)考慮下pcr前三個(gè)循環(huán)，相信你能懂的。

你好，我剛剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，好多不懂，想問(wèn)一下你，PCR前三個(gè)循環(huán)有哪些要注意的啊，我做PCR時(shí)就用genetool拖引物拿師兄給的體系跑，他們沒(méi)有說(shuō)這個(gè)問(wèn)題。

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9樓2015-07-12 16:27:11

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6樓: Originally posted by hg30717580 at 2015-07-10 16:22:27
把你的模板質(zhì)粒稀釋下作為模板再PCR擴(kuò)增下試試看。

我稀釋過(guò) 10 50 倍就沒(méi)有帶了

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10樓2015-07-13 11:42:21

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