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白色實(shí)驗(yàn)服新蟲 (初入文壇)
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[求助]
測定土壤酶活力過程中的問題 已有3人參與
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小弟最近在測定土壤酶活力，常見的幾種酶。像蔗糖酶（比色法）、脲酶（苯酚鈉-次氯酸鈉比色法）、蛋白酶（茚三酮比色法）、纖維素酶（硝基水楊酸比色法）等…… 但是，在測定蛋白酶的時(shí)候出現(xiàn)一系列問題如下： 1：1、蛋白酶測定的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)組和對照組（無土+無基質(zhì)）全部出現(xiàn)茶色，并沒有出現(xiàn)應(yīng)該出現(xiàn)的藍(lán)紫色，做了四次，全部都是茶色，不知道哪里出現(xiàn)問題了； 2、用酪素做基質(zhì)，波長為500nm，用明膠做基質(zhì)，波長為560nm，請問到底波長用多少合適？ 3、培養(yǎng)結(jié)束后，過濾之前還是之后加入沉淀蛋白質(zhì)的試劑，加入后需不需要離心？離心轉(zhuǎn)速多少？離心在過濾之前還是過濾之后好？ 4、沒有離心，培養(yǎng)后直接過濾，過濾速度很慢（超級慢的那一種），這個(gè)現(xiàn)象合理不合理，如果不合理，該怎么做？ 5、用酪素做基質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線用甘氨酸繪制？還是酪氨酸繪制？明膠做基質(zhì)曲線用什么繪制呢？（查閱了很多文獻(xiàn)，方法有的各不相同，希望大神解答……） 我用茚三酮比色法（酪素基質(zhì)），測定波長為500nm；加勒斯江法（明膠基質(zhì)），測定波長為560nm；實(shí)驗(yàn)還是不出結(jié)果，希望蟲友幫助，小弟不勝感激…… 在測定纖維素酶活力的時(shí)候，出現(xiàn)過濾很慢（無法想象的慢，甚至我懷疑過濾都停止了），不知道離心或者用布氏漏斗可以不可以（今天打算試一下的）……或者蟲友有更好的解決辦法。 第一次發(fā)帖，不便之處請見諒。剛簽到三天，金幣不多……希望大家能幫小弟解決這些問題，在線等。 |
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土壤脲酶的測定方法（苯酚鈉—次氯酸鈉比色法） 1、試劑 1）甲苯； 2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml； 3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀（KOH）溶于蒸餾水。將兩溶液合并（會(huì)暴沸，混合時(shí)要注意），用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋定容至1000ml； 4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml； 5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定； 6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋10倍（吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 2、操作步驟 稱取5g土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后過濾，過濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計(jì)與578nm波長處比色。（靛酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在測定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計(jì)上于578nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3、結(jié)果計(jì)算： 以24小時(shí)后1g土壤中NH3－N的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性（Ure）。 Ure=（a樣品－a無土－a無基質(zhì)）×V×n／m式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3－N毫克數(shù)；a無土為無土對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3－N毫克數(shù)； a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3－N毫克數(shù)； V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積／吸取濾液體積；m表示烘干土重 |
5樓2015-08-25 16:07:46
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8樓2015-08-25 17:08:36
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蛋白酶對照組貌似就是近于茶色，我懷疑是蛋白酶活性比較低，樓主可以適當(dāng)增加土壤量或者延長培養(yǎng)時(shí)間試試。然后根據(jù)土壤量和時(shí)間調(diào)整計(jì)算公式。纖維素酶因?yàn)榛|(zhì)問題就是很慢只能等著，木有什么好辦法 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2015-08-30 20:14:29
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