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東樂樂金蟲 (初入文壇)
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[求助]
用組織提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行PCR一直未有目的條帶，請大家?guī)兔Γ? 已有3人參與
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我打算做質(zhì)粒構(gòu)建，但是第一步PCR就進行不下去了。采集新鮮組織后立即用Trizol法提取RNA，用takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到的cDNA，用師兄師姐留下的引物進行PCR可以擴增出相應大小的目的條帶（約1500bp），但用我自己設(shè)計的幾對引物都不能擴增出條帶（目的條帶大�。�3564bp），只有最下面有疑似引物二聚體的條帶，其余的一條帶也沒有。我想要獲得該基因的CDS全長，之后進行細胞轉(zhuǎn)染。選的酶切位點和載體都是實驗室里現(xiàn)有的。實驗新手有很多不懂的，請大家?guī)臀蚁胂朕k法，謝謝大家！ 克隆載體：19T【T-Vector pMD19(Simple)】 表達載體：pEGFP-N1 引物：（其它引物跟這個差不多就是上下幾個堿基的增減） 上游：5‘-CCCAAGCTTGCCACCATGCCTTTTGGTCTGAAGCTC-3‘[Hind III酶切位點，我引入了Kozak序列(GCCACC序列)，據(jù)說這樣有利于以后的表達] 下游：5’-CCGGAATTCTTAAATGAGTCTGGAGTTTTGGAGG-3’(EcoR I酶切位點) 體系：共25μl 高壓過的純水 16μl 10X LA PCR Buffer II (Mg2+ plus) 2.5μl dNTP Mix 2μl 引物上游、下游各1μl cDNA模板 2μl Takara LA Taq 0.5μl 條件：35個循環(huán) 94℃ 2min（3min也做過） 94℃ 30s 55℃（58℃和61℃也做過）1min 72℃ 4min 72℃ 10min 4℃ ∞ CDS序列：共3564bp ATGCCTTTTGGTCTGAAGCTCCGCCGGACACGGCGCTACAACGTCCTGAGCAAGAACTGCTTTGTCACACGGATTCGCCTGCTGGACAGCAATGTTATCGAGTGCACGCTGTCGGTGGAAAGCACAGGGCAAGAATGCCTGGAGGCTGTGGCCCAGAGGCTGGAGCTGCGAGAGACGCACTACTTTGGCCTTTGGTTTCTCAGCAAGAGCCAGCAAGCACGATGGGTGGAGCTGGAGAAACCTCTGAAGAAACATCTGGACAAATTCGCTAATGAGCCTTTGCTTTTCTTTGGAGTCATGTTCTATGTGCCAAATGTGTCATGGCTTCAGCAAGAGGCCACAAGATATCAGTATTACCTGCAAGTCAAAAAAGATGTGCTTGAAGGGCGATTACGATGTACATTGGACCAGGTGATTCGGCTAGCCGGCCTAGCTGTGCAAGCTGATTTTGGAGACTATAATCAGTTTGATTCTCAAGATTTCCTCAGAGAGTATGTGCTATTTCCTATGGATTTGGCCCTGGAAGAGGCTGTTCTGGAGGAGCTGACCCAGAAGGTAGCCCAAGAACACAAAGCCCACAGTGGAATCCTGCCAGCAGAAGCTGAACTGATGTACATCAATGAAGTTGAACGTTTGGATGGATTTGGACAGGAAATCTTCCCTGTAAAGGACAATCATGGAAACTGTGTACACCTTGGCATTTTCTTTATGGGGATTTTCGTGAGGAACAGAATTGGAAGACAAGCGGTAATATACAGGTGGAATGACATGGGGAATATCACTCATAACAAGTCGACCATTCTAGTGGAGCTCATCAACAAAGAAGAGACTGCCCTCTTTCACACGGATGATATCGAAAATGCCAAGTATATTTCTCGGTTGTTTGCCACACGACACAAGTTTTACAAACAAAACAAAATCTGCACTGAACAGTCAAATTCTCCACCCCCCATCAGACGCCAGCCCACCTGGAGCCGATCCTCTCTGCCCAGGCAGCAGCCGTACATCCTGCCTCCCGTTCACGTCCAGTGTGGTGAGCACTACTCGGAAACGCACACCTCGCAAGACAGCATTTTTCATGGGAATGAAGAAGCCTTGTATTGCAACTCTCACAACAGCCTGGACTTAAATTATTTAAATGGCACTGTCACCAATGGCAGCGTGTGTAGCGTTCACAGCGTCAACTCCCTCAACTGCTCGCAAAGTTTCATCCAGGCCTCCCCTGTATCCTCCAACCTCAGTATCCCTGGGAGTGACATCATGCGGGCCGACTACATCCCGAGCCACCGGCACAGCGCGATCATCGTGCCCTCGTACAGGCCAACCCCCGATTATGAGACAGTCATGCGCCAGATGAAGAGGGGGATCCTGCATACAGACAGCCAGAGCCAGTCTCTGAGAAACCTCAACATTATCAACACCCATGCCTACAACCAGCCAGAGGATCTGGTGTACAGCCAACCGGAGATGCGGGAGAGGCACCCCTACACTGTCCCTTATGGGCCACAGGGGGTCTACAGCAACAAACTTGTCAGTCCATCTGACCAGAGGAACCCAAAGAATAATGTGGTACCAAGCAAGCCGGGGGCAAGCGCCATCTCGCACACGGTGAGCACCCCAGAGCTGGCCAACATGCAGCTGCAGGGCAGCCATAACTACAGCACGGCCCACATGCTTAAGAACTATCTCTTCAGGCCACCGCCCCCCTACCCACGGCCACGACCTGCCACCAGCACCCCAGACCTGGCCAGCCACCGCCACAAGTACGTCAGCGGCAGCAGCCCGGACCTGGTGACCCGGAAGGTGCAGCTCTCGGTGAAGACCTTCCAAGAGGACAGCTCTCCGGTGGTTCATCAGTCTCTCCAGGAGGTGAGCGAGCCCCTCACGGCCACCAAGCACCACGGCACTGTGAACAAGCGCCACAGCCTGGAGGTGATGAACAGCATGGTGCGGGGCATGGAGGCCATGACGCTCAAGTCGCTCCACCTCCCCATGGCTCGCCGCAACACGCTCCGGGAGCAGGGACCGCCCGAGGAGGGGTCAGGCAGCCACGAGGTCCCCCAGCTCCCTCAGTATCACCACAAGAAGACCTTCTCTGATGCCACTATGCTAATCCACAGCAGCGAGAGTGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCTCCAGAATCGGTGCCCCAGATCCCCATGCTCCGGGAGAAGATGGAGTACAGTGCCCAGCTGCAGGCGGCCCTGGCCCGCATCCCCAACAAGCCCCCGCCTGAGTACCCCGGTCCAAGGAAGAGTGTGAGCAATGGGGCTCTGAGGCAGGACCAAGCCAGCCTTCCTCCCGCCATGGCCAGAGCCAGGGTGCTGAGGCATGGGCCAGCCAAGGCCATCAGCATGTCTCGGACTGACCCGCCGGCTGTCAACGGGGCCTCTCTCGGCCCATCCATCTCGGAACCCGACCTGACTAGTGTGAAGGAGCGGGTCAAAAAAGAGCCTGTGAAGGAGAGACCTGTGTCTGAAATGTTTTCCCTGGAAGACAGCATTATAGAGAGAGAGATGATGATCAGGAATCTAGAGAAGCAGAAGATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAGAGGCCGCTGATGTTGGCAGCATTGAATGGGCTCTCGGTGGCTCGAGTCTCAGGGCGGGAAGAGAATCGAGTTGATGCCACCCGGGTTCCCATGGACGAGAGGTTCAGAACCCTGAAGAAGAAACTAGAAGAGGGAATGGTGTTCACAGAATATGAGCAAATTCCAAAGAAAAAGGCGAATGGCATTTTCAGCACAGCAGCTCTGCCAGAAAACGCCGAGCGCAGCCGAATCCGTGAAGTTGTCCCCTATGAGGAGAATCGAGTAGAGCTGATACCAACCAAAGAAAATAACACAGGATACATTAATGCCTCCCACATCAAGGTGGTGGTTGGCGGGGCAGAATGGCACTACATAGCCACCCAGGGGCCCCTGCCACACACGTGCCACGACTTCTGGCAGATGGTGTGGGAGCAGGGAGTGAATGTGATTGCCATGGTCACTGCAGAGGAGGAGGGTGGACGAACCAAAAGCCACCGATACTGGCCCAAACTAGGTTCAAAGCACAGCTCAGCCACCTATGGCAAGTTCAAGGTCACCACGAAGTTTCGAACGGATTCTGTTTGCTATGCAACCACGGGCTTGAAGGTCAAGCACCTTTTGTCTGGGCAAGAAAGGACGGTGTGGCATTTACAATATACTGACTGGCCAGATCACGGCTGTCCAGAAGATGTCCAAGGATTTTTATCCTACTTGGAGGAGATCCAGTCGGTCCGTCGCCATACCAACAGCATGCTGGAAGGCACCAAGAACCGGCACCCGCCCATCGTGGTCCACTGTAGTGCTGGGGTGGGAAGGACCGGCGTGCTCATTCTTTCTGAGCTGATGATCTACTGCTTGGAACATAACGAAAAGGTGGAAGTGCCCATGATGCTGAGGCTCCTCAGGGAGCAGAGGATGTTCATGATCCAGACTATCGCTCAGTACAAGTTTGTCTACCAAGTCCTCATCCAGTTCCTCCAAAACTCCAGACTCATTTAA 總的mRNA序列：其中654bp至4217bp為CDS區(qū)域 ACTCGCACGGCCCCTTCCTCCCTCCTCTCCCGGCCGCTCGCATTTCCTGCCGCTCTGGCTCTCCCGGCCCCTCAAAGTTCTTTCCAACTTTTTCTCGGCGGAGTGAGCGCAGCGGGCGCAGACTCGGGGGCAGGTTGCTGTGCTTCTCCGGGCTCAGCCGCCTGCTCTCCTGGCTCAGGTCCTCGGGGAGCCCTAGACAGACATCAAGTGGCCACTGGCGCTCCTTCCCCTCCCAGCTGAGCCATCCTCCCCGGCCTCCTCGGGCGGGACAGCCCCGTGCTTAGGTTTTTCTCCTTTTCTCCCCCGGTGCGCCTCTGCTCGGACTCTCGCGCCGGGATCGCGGCGGAAACCTCCCTCCCCTTTCGCCTCCTGCGGCTCCTTCCCTTCGCCCCTCCTCCGCCAGTCACTGGAATCAATTCCGTGGGGAATCGGCTCCGCCGCCGCGAAGGACAGCCTTTCCGCGCGGGACTCCGGGGCGCCACGGGGGCCATGTAAGCAGCTATCTTCCAGAGGGCCACACTGGGCATGGACACCCTTTTCCCTGCCTGGAGGAGCACAGGTGATAGTGTAATTTTCCAGTCACGAAACTGCTAAGGCCATCTCAGGGGCGTGTGCGCCAGGATAGGCGGGCGGCGTCCGAGGACCACATAGCCATGCCTTTTGGTCTGAAGCTCCGCCGGACACGGCGCTACAACGTCCTGAGCAAGAACTGCTTTGTCACACGGATTCGCCTGCTGGACAGCAATGTTATCGAGTGCACGCTGTCGGTGGAAAGCACAGGGCAAGAATGCCTGGAGGCTGTGGCCCAGAGGCTGGAGCTGCGAGAGACGCACTACTTTGGCCTTTGGTTTCTCAGCAAGAGCCAGCAAGCACGATGGGTGGAGCTGGAGAAACCTCTGAAGAAACATCTGGACAAATTCGCTAATGAGCCTTTGCTTTTCTTTGGAGTCATGTTCTATGTGCCAAATGTGTCATGGCTTCAGCAAGAGGCCACAAGATATCAGTATTACCTGCAAGTCAAAAAAGATGTGCTTGAAGGGCGATTACGATGTACATTGGACCAGGTGATTCGGCTAGCCGGCCTAGCTGTGCAAGCTGATTTTGGAGACTATAATCAGTTTGATTCTCAAGATTTCCTCAGAGAGTATGTGCTATTTCCTATGGATTTGGCCCTGGAAGAGGCTGTTCTGGAGGAGCTGACCCAGAAGGTAGCCCAAGAACACAAAGCCCACAGTGGAATCCTGCCAGCAGAAGCTGAACTGATGTACATCAATGAAGTTGAACGTTTGGATGGATTTGGACAGGAAATCTTCCCTGTAAAGGACAATCATGGAAACTGTGTACACCTTGGCATTTTCTTTATGGGGATTTTCGTGAGGAACAGAATTGGAAGACAAGCGGTAATATACAGGTGGAATGACATGGGGAATATCACTCATAACAAGTCGACCATTCTAGTGGAGCTCATCAACAAAGAAGAGACTGCCCTCTTTCACACGGATGATATCGAAAATGCCAAGTATATTTCTCGGTTGTTTGCCACACGACACAAGTTTTACAAACAAAACAAAATCTGCACTGAACAGTCAAATTCTCCACCCCCCATCAGACGCCAGCCCACCTGGAGCCGATCCTCTCTGCCCAGGCAGCAGCCGTACATCCTGCCTCCCGTTCACGTCCAGTGTGGTGAGCACTACTCGGAAACGCACACCTCGCAAGACAGCATTTTTCATGGGAATGAAGAAGCCTTGTATTGCAACTCTCACAACAGCCTGGACTTAAATTATTTAAATGGCACTGTCACCAATGGCAGCGTGTGTAGCGTTCACAGCGTCAACTCCCTCAACTGCTCGCAAAGTTTCATCCAGGCCTCCCCTGTATCCTCCAACCTCAGTATCCCTGGGAGTGACATCATGCGGGCCGACTACATCCCGAGCCACCGGCACAGCGCGATCATCGTGCCCTCGTACAGGCCAACCCCCGATTATGAGACAGTCATGCGCCAGATGAAGAGGGGGATCCTGCATACAGACAGCCAGAGCCAGTCTCTGAGAAACCTCAACATTATCAACACCCATGCCTACAACCAGCCAGAGGATCTGGTGTACAGCCAACCGGAGATGCGGGAGAGGCACCCCTACACTGTCCCTTATGGGCCACAGGGGGTCTACAGCAACAAACTTGTCAGTCCATCTGACCAGAGGAACCCAAAGAATAATGTGGTACCAAGCAAGCCGGGGGCAAGCGCCATCTCGCACACGGTGAGCACCCCAGAGCTGGCCAACATGCAGCTGCAGGGCAGCCATAACTACAGCACGGCCCACATGCTTAAGAACTATCTCTTCAGGCCACCGCCCCCCTACCCACGGCCACGACCTGCCACCAGCACCCCAGACCTGGCCAGCCACCGCCACAAGTACGTCAGCGGCAGCAGCCCGGACCTGGTGACCCGGAAGGTGCAGCTCTCGGTGAAGACCTTCCAAGAGGACAGCTCTCCGGTGGTTCATCAGTCTCTCCAGGAGGTGAGCGAGCCCCTCACGGCCACCAAGCACCACGGCACTGTGAACAAGCGCCACAGCCTGGAGGTGATGAACAGCATGGTGCGGGGCATGGAGGCCATGACGCTCAAGTCGCTCCACCTCCCCATGGCTCGCCGCAACACGCTCCGGGAGCAGGGACCGCCCGAGGAGGGGTCAGGCAGCCACGAGGTCCCCCAGCTCCCTCAGTATCACCACAAGAAGACCTTCTCTGATGCCACTATGCTAATCCACAGCAGCGAGAGTGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCTCCAGAATCGGTGCCCCAGATCCCCATGCTCCGGGAGAAGATGGAGTACAGTGCCCAGCTGCAGGCGGCCCTGGCCCGCATCCCCAACAAGCCCCCGCCTGAGTACCCCGGTCCAAGGAAGAGTGTGAGCAATGGGGCTCTGAGGCAGGACCAAGCCAGCCTTCCTCCCGCCATGGCCAGAGCCAGGGTGCTGAGGCATGGGCCAGCCAAGGCCATCAGCATGTCTCGGACTGACCCGCCGGCTGTCAACGGGGCCTCTCTCGGCCCATCCATCTCGGAACCCGACCTGACTAGTGTGAAGGAGCGGGTCAAAAAAGAGCCTGTGAAGGAGAGACCTGTGTCTGAAATGTTTTCCCTGGAAGACAGCATTATAGAGAGAGAGATGATGATCAGGAATCTAGAGAAGCAGAAGATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAGAGGCCGCTGATGTTGGCAGCATTGAATGGGCTCTCGGTGGCTCGAGTCTCAGGGCGGGAAGAGAATCGAGTTGATGCCACCCGGGTTCCCATGGACGAGAGGTTCAGAACCCTGAAGAAGAAACTAGAAGAGGGAATGGTGTTCACAGAATATGAGCAAATTCCAAAGAAAAAGGCGAATGGCATTTTCAGCACAGCAGCTCTGCCAGAAAACGCCGAGCGCAGCCGAATCCGTGAAGTTGTCCCCTATGAGGAGAATCGAGTAGAGCTGATACCAACCAAAGAAAATAACACAGGATACATTAATGCCTCCCACATCAAGGTGGTGGTTGGCGGGGCAGAATGGCACTACATAGCCACCCAGGGGCCCCTGCCACACACGTGCCACGACTTCTGGCAGATGGTGTGGGAGCAGGGAGTGAATGTGATTGCCATGGTCACTGCAGAGGAGGAGGGTGGACGAACCAAAAGCCACCGATACTGGCCCAAACTAGGTTCAAAGCACAGCTCAGCCACCTATGGCAAGTTCAAGGTCACCACGAAGTTTCGAACGGATTCTGTTTGCTATGCAACCACGGGCTTGAAGGTCAAGCACCTTTTGTCTGGGCAAGAAAGGACGGTGTGGCATTTACAATATACTGACTGGCCAGATCACGGCTGTCCAGAAGATGTCCAAGGATTTTTATCCTACTTGGAGGAGATCCAGTCGGTCCGTCGCCATACCAACAGCATGCTGGAAGGCACCAAGAACCGGCACCCGCCCATCGTGGTCCACTGTAGTGCTGGGGTGGGAAGGACCGGCGTGCTCATTCTTTCTGAGCTGATGATCTACTGCTTGGAACATAACGAAAAGGTGGAAGTGCCCATGATGCTGAGGCTCCTCAGGGAGCAGAGGATGTTCATGATCCAGACTATCGCTCAGTACAAGTTTGTCTACCAAGTCCTCATCCAGTTCCTCCAAAACTCCAGACTCATTTAATCACCCCAATCCAGCTCCTGGAGGAGGGACCCAGCTCCATCGCGCTGGAGGAGAGTCACCTCCAGACAACATCTGCTCCCCCCACAGGGGTGCAGGTGGCTGGCAGCAAACAGGCTCTCTGAAGACAGTAGCCAAGATTATTCACACATACCATGTATTATTTTATATGAGATAATTTATTTTTTTCCCCTTTGGAATAACTTTTGTGAATTATTATAATGCAGTTTCCCTAGTAATATAGTACTTTTCATTTGAACCACATCTTGACTGATCTGTATTGTAATATATGTCAGCAGGTAAGGTTGCCTGCTGGATCATTTTGAGGACAGAGGCATGAGGGAGCACATCTCTTGTGAAGTTGCAGCCAGATTTGTAACCAACCCTGAAATTCATCAGCTTAATTCATTTATCAGCTTGATTCATTCATCATTCATTGCTTATATCCAAAGCAAAGACGGTAAGAAAATGAATTCATCCTGAAATATAAAGAAAAGGGTCTGAAGGAACAAACACGATTCTCTTATATTTTGGGGCTCATGAGCCTTGATAGACAGTTTCCTCTCGTCTTCATTTCCACCCCTCATCCTCAGTAGTCTCCTCTCCCCCACGCCCCACCCCAACTTCCCCCCCAAGCTTGAGTTAAAGACAGAATAGCTAAAGACAGTGCTGCCTTTACAATGCAGTAATTGCCATCTTTGGGGCCGAAAGACAAGCTCTGTGTTGTGCTTTTCTTGACCACCCCTTATCCTGGGCTCTGGAGCTTGTGTTTCCCTGCTGGCGACTGTACCTTGGGTATTTGTTGCTACCTCTCCTGTTTGCTCAGTAGGACCCTGTCTGGTGGCATTGAGGCTCTGGACCAGACCATCTGTGCAGTTAAGGCTCTACCCTGATTGAGAGAGGATAGCAGACCTAGAAAGAGAAAGGAGTTGGGCAGGGCCTTTGAGGATTGTGTTTTTCAGGCAGGGCCTTGATGATCATTGTTTTTTATTTAAATAAGATGTGTGTGCTGGACAGAGACCTAAAAGTTGAGGTCACTAAGTCATTGGAAAGGCCATCAAGGAAACAGATGGGGAAGCTGATTTATGGGAGCTGTAAGGCATTTAGCTACATAACAGGGGTCCTGGCCAGGAAACACATCAAATGTGACCCCCGCTGTGCTGATATCATCTTCAGGCTTTGGTCTGCAAGATCAGAATTAATCCCACTCGGGACCCCATAGTCCAAACTTGGGGCCACTTGATGAACGATGGTAGAATTGTCATTGGCAGAGCCCTGTGCTTCTTTCCTTTTCTTCATAAAATCCACTCGCTGGTCAGTTATCTTCACTTTGAAGCCCAGTTCTTAGTTTCTTCCTATGGCTTCATTGGTCAGTGTCCTTCTGAATTTCCAAGGATGGTACACAATAAATCATGTTTTGTACTTTTTTCCTCTTACTGCATTTTGGGGGATTTATCATTCTATGTCTACCTTTTCTTGAGTACAGCTTTGATATGCACCTGTTGTTACGTGGTGATGGGAAGTCACAGGCGTGCTCTTTCTAGTTAATTTGATGCCACATCTTCCTTGTCTTTTCAGCTTGGGAAAAAGGCGGCAGTGGAGGAAGGCATGGAATGCCCACAGTGGTCAGTTCAAAGAACAAACGTGCAATTAAAAAACTGTAGTCAGCCAGGCACGGTGGTTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGAAAGGCCAAGGCGGGCAGATTGCTTGAGCTAAGGAGTTCGAGACCAGCCTGAGCAACATGATGAAACCCCGTCTCTACAAAAAGTACAAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGTATGCCCTGGTAGTCCCAGCTGCTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCACCTGATTCTAAGAATTCGAGACTGCAGTGAGCCGTGATCTTGCCACTGTAGTCCAGGCTGGGCTACGGAGAGACCCTGCCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAAGGTTGTCAAGAAAAACTAGATGTTAGGAGAAAGGAAAATTTAATTGCAGTTTTTTTTCTTAGAATTGACTGCTGTGAGAGTTCCATATGCCTTTCTTCATTGCTGCTTTTGTCCCCCGTGAGCTAAAAAGATGGAGTGACATCAAATCAACCAGAAAAAGTATGCCTTTGTGACATCCCATCACCACATGCCAACAGGTATATATTCCCCATTAAGTTCTTCGGAATAGGAATCCTCTGTTTCAACCTGGCCAGGTGTTGTGGTGGCTGTACTCTAGTTAGACTCGGAATATCTGGGGATGGAGGGCTTCCCCTGTGTCTTCTACTTCAAGGTCTGAAGGCTCAGTGAAGGAGTATAATCTGCTGATCTTTGTAGATTCTGGAGTTTTGTTGTATGTCCTGGAAAGAAACCCATTAGTATTACATGTATTTTCAGTGAACAGAGCTTATAACCCTTATTATAAGAAGCTCATCAATAAGCAAAAAGATACTTGTTTCCTTTCCTTGGAGGTTTTTCCATCCTTGGGATATTCTGCTGTTAGGGATGTTTTAGCAAGTGGTCTCAGTTACTGGTTTATTGCGTGATGAACAACATCAGTATTTATCTTTTATCTCTAAGCCCCAAGGTGGGCACTGTTAGAATATGTCTCATGTGGACAGCATATAGATCTGGTGCGTCTTTGAGGTCGTCAGAGCTCATGGGCTTCCCTGAAATTCATCCACTGTCCCTGCCGTATGCTACGGGAATATTCATTAGTGTACAAAATGCAGGGAGGAAGTAGGTTTAATATTCAACTTTCTAGCCAAAGTTTATATTGAAACCCAAAAGAAAACATTTAAGAGTTGTTCCACATATTTCACTTTTAAAAACAAATGCCTTTGGTTCTTTAGCACATTTTGCATTCCTTTTCACATCTCCAGTAAATGCCAACATATCTCCTGTTAAATTAGCAGCAGCCATTTAAAGTCCTTTCGGTGGCATCTGCATAATAATTGCCCAGAGATGCTTTATATCTGGGAAGCAAGCCAAGGAATAAACCTTGAAGCAAAGTGTATTAAATTAGTTATCTAGTTAGAGCTTTTGGAATGATTTCCTGATGATGTATCAAGTCTGAAGCTGGAGCTGTCAGTGTCTATTGCTGCAGTTTGGATTTGAAGGGAGAAAATGTAAAATGGAGGAAAAAAAAGTTACCATCTCACAACAAAGCCATCAAACATTTTCCAGCCGCTGTTTTCGAGGTTTTCCAGTTGAACTGTTTGGTTTCTTTCATCCACACTCATTTGGATACATTGACCCGAGGTATTCATCCTTGTTTACTGTGGTCCCTGAATCATGGGGGCTGAATTTGATGTCTTCATCCTTGAGATGAGCCTGCTGGCTTAGCTGAGGAATGTCCTGCTGAGGTTTCTTAGGTTTCCTTGGGTTCTAAGGATATACTGGATATACCATCTTTTAGCAAGAGTATCTGGTAGCATTTACAGATAGCATAGACATTGGTATGCACTTCTTTCCCCAGATAGGAAGTAAAGGAGGATTTAGTTGCATGAAAAAAGGATGTTAAACATTGATTACATAGGAGTAAAGATGAATGAGCTGCAATATTCAGTCGGAGCTAAACAATAAGATCAGGGAAGGTAAAAATACCTATGTGGAATATTTTGAATCGTAAGCTTTTGAGGAGCTTAAATTGAGAGAATTTTACTTTTAATTTTGTAGATTGAGAAGAGGAACCGCTTTTTAAAATTATAGCTAAACTGTCATTGTTTTCCTAAGAGTCACTTGGCCATCTCTGGCCCCCTCTTTCATCAGCCTGAAGAGAGGGTCTTTGTAGACTGCTGAGGGTGGGCCTTGTAGGACTTGACCATGGCTTACACCTACTTAACCTTTATCCTGCTTTCTTTCAGCTTGTGCTTTTCAGTTATAAACTCCAGTGGGTACAGCAGGCTGGCCTTTTCATCCAGCTGATTATTTTTCCAGCTTAATATAGATTGACCCATATGAAATTTCCAATAATGGACCATATTTTCTGCAAATAGACAGTACTCGCATGGATCACCTATATCTTCCCCCTGATACACTGTGGGTCCCAACACCAGATGTCATTTCTCCAGAGCAGTGCTAATGAACACAAAAGGTATACCCTGGGTGGCCCAGCTCTTTTCACGAACGTGCTGCCCTGCTCATAGTGATCCTTGCATCACTTGGTGAATGGGCCATCTCCTGGGACATGGAAGTTGCAGAGGTAGATAGTGCACTGCAGCTTCTCTTAAGCCGGATTGGCCATCAGGCATATCACTCTGGAGTTTTTAGCTGCTGTCCTTTCCCGATGAACAGTCTGTATTAGCTGACCTCAGCCTACTTGTTACGTGACGTATGGGTCCCAAAAGTGTCCTTTGTCAAAAAGCAGAATGTGCCTTCTAGTCTCCCTTTCCCCATCTAATGGTGTATTCGATGGTGAAGATGAGTACAGTTGACCACCCCTATCTGTGGGTTCCACATCCCTATATTCAACCAAGTACAGATTGAAAAATATTTGGGGAAGAGGGGAAACCCACAAAGTTCCAAAAAGCAAAAGTTGAATTTGCCACATGCTGAATACTACATTGAATTCACACAAATGAAGTGATGTGTAGGCATTGAGTTAGGTATTGTAAATAATCTAGAGATGATTTAAAGTATGCAAGAGATGTGCATAGGTTATATGCAAATACTGTGCTATTTTATATAAAAGACTTGAACATCCATGGATTCTGGTATTCTCAGAGGGTCCTTGATTGCCCCCTTTGGTAAAGGACAACTATTTCGTTACTGATTTTCGTTTGGGGAAGATCTGTCAATCCCTTGAGGTGCGGGGGTTGGGGGGATGGAGGGTACAGGGCATTCTAGGATGTGTGCCAGGGAGCACAGATTCAAGGGATGGGATTGAGTCAGACCTGTGTTCTTACTCAGTGTCAGAAATAACTCTGTGGAGCTCCTAGAGTAAGACATTTCCGGAAGCACCACATAATTACTGTTGGGCTCTTAGGGTAGCCCTTTTAGGGAATTGAGCATTCCCATGTTTTACCAACAATTATTCTGCTGCTGTGTTTTATTATATTGCCAATGGTTTTGAGACACTCATCATGCTCTTATTTAGTGATTTCTTTTCATGAGCAGAGCAACAGCTCATCCAGCATGGTTTCCAAATGGAGAAATTTGGGTCTTCTGTAGAAACCACACAAATTCTCCAATGGCCTACAGCCTTATGGTTGGCACACTAGTTGGCCCTATAGGGTGGAAATAAAGCTGTAAGATGTTAAACTGCATTTGATACTTCTCTTGAACGCTGAGCAAGGAAGCAAAATAGTTCTTGTCTTTACTTAAGCTTCTAAGACATTTTGGGGCAAAGGACCTTACAGATGGCGTCTGTTGAAAGTAACAGCAACGTGCCAGGGAGAAATGTGGGGGAAATCTCATCAAATTCTGCCACCTCAAATGTGTTGTCCAGAAGTCAGTGTTATTCAGGGGGCCCTGTGAAACTTGACCACCAGCTTGCGCCATCAACACTCAGCCTTTATCCAGCCTGCTCTCAGCTTTTGTGTTTCTGTTAGAAACTCAGATAGGTAAGTATTTTTATTCAGTAGACTACCTTTCTTATCTTTTCAGCTTAATATAGCTGCATCTTCTTTCTCAAAGCCAAACTAAGATATTCTCTATTAAAATGTCCATGAGCCTAGCATTGAGTGTCTGGCATCCATCAATTTCATAGACTGGAAAATGATTGTTGTTTGGTACAGTAAAGAAGAGGATGTGCATCAGTTCCTACCGTTTGCA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liping121200
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東樂樂
2樓2015-10-16 15:45:27
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3樓2015-10-19 09:05:11
4樓2015-10-19 12:02:43
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我當年也是三千多的片段，很弱，我用kod fx酶，保證性高，p了兩管收集到一起膠回收的，然后二次pcr，不過takara的反轉(zhuǎn)試劑盒的保證性不是特別高，我曾經(jīng)遇到過突變的情況 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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5樓2015-10-19 12:07:31
6樓2015-10-19 12:10:37
商家已經(jīng)主動聲明此回帖可能含有宣傳內(nèi)容|
太長了。很難轉(zhuǎn)錄出這么大量完整的cDNA。還是分成幾段吧。1kb一段，分別PCR，然后再通過無縫拼接的方法克隆到一起。 建議這種體力活還是送到公司來做比較省事。這樣可以省下不少時間來看文獻，設(shè)計實驗。 如果需要的話，歡迎咨詢tolobio@126.com |
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7樓2015-10-19 12:21:37
董博士
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10樓2015-10-19 18:29:46
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