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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » DNA重組 » 重組質粒的驗證
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wuyuanqing金蟲 (正式寫手)
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[求助]
重組質粒的驗證 已有2人參與
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| 各位大俠，本人最近做一個克隆，轉化后挑取單克隆，LB搖菌后，進行菌液PCR，引物為我克隆基因的上下游引物，結果顯示，有兩個克隆出現目的大小條帶，而且亮度很大（遠遠高于marker中最亮的條帶），于是信心滿滿地提取質粒進行酶切驗證，結果，電泳顯示無任何條帶，將質粒上樣后也五條帶，懷疑是試劑盒的問題后，換一種試劑盒提取，提取物上樣電泳顯示，沒有質粒。這是為什么呢？請賜教，謝謝！ |
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q120465872
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數 +1
|
我來完整解答你的問題。 首先，你的菌液PCR設計方式不對。從連接轉化到挑單克隆菌液PCR這一套完整流程走下來，你最開始做連接的PCR產物還是殘留在體系里的，他們并沒有反應完全，可能隨后續(xù)的操作一直存在于體系中（注意是可能，不是一定，不要鉆牛角尖啊，  ）， 僅憑你槍頭的觸碰就足夠進入你菌液PCR的體系成為模板被擴增出來。要充分注意PCR的靈敏度，即使稀釋百萬倍，輕微觸碰，都可能被檢測出來，造成判斷失誤（血淚教訓�。�所以，你在設計菌液PCR驗證的時候必須避開這個問題，避免被殘留的可能存在的成分干擾你的判斷。一般載體引物一對+PCR產物本身引物一對嵌套檢測是比較靠譜的，出來兩個條帶如果差異大小正確基本就不會出問題了。 |
wuyuanqing
9樓2015-10-24 20:02:00
kangaroo0513
新蟲 (正式寫手)
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數 +1
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3樓2015-10-24 12:22:08
5樓2015-10-24 14:12:29
6樓2015-10-24 17:19:38
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