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yby_ybh007新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于重組質(zhì)粒的問題
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最近在做雙元載體的構(gòu)建，載體是PBI101-ProIQM4-IQM4-GFP，已經(jīng)連接轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，涂布后有菌生長，挑單菌落進(jìn)行菌落pcr并轉(zhuǎn)板，一共做了3次pcr的驗證，每次都有轉(zhuǎn)板，pcr的引物分別是①ProIQM4的引物、②IQM4的前向引物和GFP的反向引物、③ProIQM4的前向引物和IQM4的反向引物，pcr都有陽性對照（用ProIQM4-IQM4-GFP的質(zhì)粒），pcr驗證后就進(jìn)行搖菌提質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒非常難提取出來，我用的是takara的試劑盒，后來提取了一次質(zhì)粒濃度大約50ng/ul的，進(jìn)行了單酶切和雙酶切以及pcr驗證（pcr是質(zhì)粒稀釋50倍后加了1ul），pcr做了兩組引物（引物①和引物②），電泳跑膠后（1%的膠）單酶切和雙酶切只有marker有條帶，樣品沒有任何條帶，①引物有非常亮的特異性條帶，②引物只有marker有條帶。于是跑了一下質(zhì)粒，用了5ul，同樣沒有任何條帶。感覺好像質(zhì)粒濃度的問題，于是重新?lián)u菌提質(zhì)粒，這次質(zhì)粒濃度有65ng/ul，同樣做了相同的驗證，但是這次所有驗證都沒有任何條帶，除了marker，這到底是什么問題，是我做連接轉(zhuǎn)化的時候沒做好嗎？還是其他地方出了問題了，感受態(tài)轉(zhuǎn)化后的pcr驗證也是一步一步來的，也做好了標(biāo)記，確定是有特異性條帶才往下做的。在提質(zhì)粒那方面，因為實在沒有太好的方法，我采取了多管菌液離心后加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，過同一個柱子的，難道這樣是不行的？求各位大神幫忙，指點(diǎn)一下小弟啊�。�！ 附上一張?zhí)崛≠|(zhì)粒后測的濃度！A260/A280好像偏大了，這個地方有問題嗎？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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黃宇良
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2樓2016-02-27 19:03:35
jackyoung
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-02-28 10:12:52
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-02-28 10:12:52
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原因還是質(zhì)粒濃度太低，那個載體太大，按照分子量計算你切出的條帶的量更少，所以達(dá)不到凝膠上觀察的量。而一旦真實存在，通過PCR的方式是可以檢測到的。認(rèn)真地給你說一句，質(zhì)粒提取試劑盒弄出來的量偏小，一旦洗脫不當(dāng)，產(chǎn)量更少。手提吧，我們談笑間手提質(zhì)粒幾十管，感覺就是民工… 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-02-27 19:52:05
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