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wuyuanqing金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
重組質(zhì)粒的驗(yàn)證 已有2人參與
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| 各位大俠，本人最近做一個(gè)克隆，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆，LB搖菌后，進(jìn)行菌液PCR，引物為我克隆基因的上下游引物，結(jié)果顯示，有兩個(gè)克隆出現(xiàn)目的大小條帶，而且亮度很大（遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于marker中最亮的條帶），于是信心滿(mǎn)滿(mǎn)地提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果，電泳顯示無(wú)任何條帶，將質(zhì)粒上樣后也五條帶，懷疑是試劑盒的問(wèn)題后，換一種試劑盒提取，提取物上樣電泳顯示，沒(méi)有質(zhì)粒。這是為什么呢？請(qǐng)賜教，謝謝！ |
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- 請(qǐng)教重組質(zhì)�？鞕z的具體方法以及原理。。。。
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q120465872
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【答案】應(yīng)助回帖
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我來(lái)完整解答你的問(wèn)題。 首先，你的菌液PCR設(shè)計(jì)方式不對(duì)。從連接轉(zhuǎn)化到挑單克隆菌液PCR這一套完整流程走下來(lái)，你最開(kāi)始做連接的PCR產(chǎn)物還是殘留在體系里的，他們并沒(méi)有反應(yīng)完全，可能隨后續(xù)的操作一直存在于體系中（注意是可能，不是一定，不要鉆牛角尖啊，  ）， 僅憑你槍頭的觸碰就足夠進(jìn)入你菌液PCR的體系成為模板被擴(kuò)增出來(lái)。要充分注意PCR的靈敏度，即使稀釋百萬(wàn)倍，輕微觸碰，都可能被檢測(cè)出來(lái)，造成判斷失誤（血淚教訓(xùn)�。�所以，你在設(shè)計(jì)菌液PCR驗(yàn)證的時(shí)候必須避開(kāi)這個(gè)問(wèn)題，避免被殘留的可能存在的成分干擾你的判斷。一般載體引物一對(duì)+PCR產(chǎn)物本身引物一對(duì)嵌套檢測(cè)是比較靠譜的，出來(lái)兩個(gè)條帶如果差異大小正確基本就不會(huì)出問(wèn)題了。 |
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9樓2015-10-24 20:02:00
wuyuanqing
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8樓2015-10-24 19:00:50
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nono2009: 金幣-20, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 禁止回帖廣告 2015-10-25 09:55:20
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2樓2015-10-24 06:32:26
kangaroo0513
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3樓2015-10-24 12:22:08
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6樓2015-10-24 17:19:38
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7樓2015-10-24 19:00:12
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送紅花一朵 |
謝謝你的建議，我這是連續(xù)做了五個(gè)克隆后第六個(gè)出現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題，一直想不通，看來(lái)以后需要這樣設(shè)計(jì)引物了。另外請(qǐng)教一下，如果是殘留，為何會(huì)在抗性培養(yǎng)基里生長(zhǎng)卻沒(méi)有質(zhì)粒？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
10樓2015-10-24 20:06:44
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