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wuyuanqing金蟲 (正式寫手)
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[求助]
重組質(zhì)粒的驗證 已有2人參與
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| 各位大俠，本人最近做一個克隆，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆，LB搖菌后，進行菌液PCR，引物為我克隆基因的上下游引物，結(jié)果顯示，有兩個克隆出現(xiàn)目的大小條帶，而且亮度很大（遠遠高于marker中最亮的條帶），于是信心滿滿地提取質(zhì)粒進行酶切驗證，結(jié)果，電泳顯示無任何條帶，將質(zhì)粒上樣后也五條帶，懷疑是試劑盒的問題后，換一種試劑盒提取，提取物上樣電泳顯示，沒有質(zhì)粒。這是為什么呢？請賜教，謝謝！ |
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- 請教重組質(zhì)�？鞕z的具體方法以及原理。。。。
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q120465872
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我來完整解答你的問題。 首先，你的菌液PCR設(shè)計方式不對。從連接轉(zhuǎn)化到挑單克隆菌液PCR這一套完整流程走下來，你最開始做連接的PCR產(chǎn)物還是殘留在體系里的，他們并沒有反應(yīng)完全，可能隨后續(xù)的操作一直存在于體系中（注意是可能，不是一定，不要鉆牛角尖啊，  ）， 僅憑你槍頭的觸碰就足夠進入你菌液PCR的體系成為模板被擴增出來。要充分注意PCR的靈敏度，即使稀釋百萬倍，輕微觸碰，都可能被檢測出來，造成判斷失誤（血淚教訓(xùn)�。�所以，你在設(shè)計菌液PCR驗證的時候必須避開這個問題，避免被殘留的可能存在的成分干擾你的判斷。一般載體引物一對+PCR產(chǎn)物本身引物一對嵌套檢測是比較靠譜的，出來兩個條帶如果差異大小正確基本就不會出問題了。 |
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9樓2015-10-24 20:02:00
wuyuanqing
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8樓2015-10-24 19:00:50
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2樓2015-10-24 06:32:26
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3樓2015-10-24 12:22:08
wxb2061
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wuyuanqing
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7樓2015-10-24 19:00:12
wuyuanqing
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送紅花一朵 |
謝謝你的建議，我這是連續(xù)做了五個克隆后第六個出現(xiàn)這個問題，一直想不通，看來以后需要這樣設(shè)計引物了。另外請教一下，如果是殘留，為何會在抗性培養(yǎng)基里生長卻沒有質(zhì)粒？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2015-10-24 20:06:44
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