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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 生物化學 » RACE 反轉錄求助
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[求助]
RACE 反轉錄求助 已有1人參與
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本人大三學生，等著實驗結果寫論文申請出國…… 現(xiàn)在卡在RACE上。 提取的mRNA經過1%瓊脂糖電泳檢驗，結果是有兩條亮帶，很少降解。 然后反轉錄上有以個問題： 隔壁實驗室給的兩個接頭引物BOD（3‘端有GGG的）和AOLP（3’端有poly T的），然后用的反轉錄試劑盒是Promega的A5000 根據說明書，采用以下操作： totalRNA 5μg AOLP 1ug 無核苷酸水（試劑盒提供） 補全到5ul 70℃ 預變性（應該是這樣的目的） 5 min后立即冰浴5 min，然后任意速度離心10 s（沒有寫出速度要求，通常用7500 rpm） 反應體系配制： 5X 的Reaction Buffer 40 ul MgCl2 （聽說Mg越多雜帶越少。但是擴增的條帶越不亮） 4 ul PCR Nucleotide Mix 10 ul RRI 0.5 ul 反轉錄酶（GoScript Recerse Transcriptase） 10 ul BDO 1 ul 用提供的Water調制 15 .0ul 冰上混合變性的RNA和反應體系 25℃ 5min 42℃ 1h 70℃ 15min 現(xiàn)在問題是，隔壁實驗室給的體系和我買的體系稍有不同， 他們用37℃（DNase Buffer、RQ DNase，RRI，RNA和水配制成體系）處理后用加 AOLP和stop solution 70℃孵育（ 終止延伸用，說讓后來的BOD結合上去） 然后在進行第一鏈cNDA合成，這時候才加BDO。 不知道以我的那種方法來做能不能達到同樣的效果。就在在反轉錄的時候在5‘端加上BDO序列。 求助求助�。�！ |
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zhangyao7255
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2樓2015-11-02 15:04:40
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zhangyao7255
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5樓2015-11-03 22:40:26
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