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引路者銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
RACE 反轉(zhuǎn)錄求助 已有1人參與
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本人大三學(xué)生，等著實(shí)驗(yàn)結(jié)果寫論文申請(qǐng)出國…… 現(xiàn)在卡在RACE上。 提取的mRNA經(jīng)過1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，結(jié)果是有兩條亮帶，很少降解。 然后反轉(zhuǎn)錄上有以個(gè)問題： 隔壁實(shí)驗(yàn)室給的兩個(gè)接頭引物BOD（3‘端有GGG的）和AOLP（3’端有poly T的），然后用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒是Promega的A5000 根據(jù)說明書，采用以下操作： totalRNA 5μg AOLP 1ug 無核苷酸水（試劑盒提供） 補(bǔ)全到5ul 70℃ 預(yù)變性（應(yīng)該是這樣的目的） 5 min后立即冰浴5 min，然后任意速度離心10 s（沒有寫出速度要求，通常用7500 rpm） 反應(yīng)體系配制： 5X 的Reaction Buffer 40 ul MgCl2 （聽說Mg越多雜帶越少。但是擴(kuò)增的條帶越不亮） 4 ul PCR Nucleotide Mix 10 ul RRI 0.5 ul 反轉(zhuǎn)錄酶（GoScript Recerse Transcriptase） 10 ul BDO 1 ul 用提供的Water調(diào)制 15 .0ul 冰上混合變性的RNA和反應(yīng)體系 25℃ 5min 42℃ 1h 70℃ 15min 現(xiàn)在問題是，隔壁實(shí)驗(yàn)室給的體系和我買的體系稍有不同， 他們用37℃（DNase Buffer、RQ DNase，RRI，RNA和水配制成體系）處理后用加 AOLP和stop solution 70℃孵育（ 終止延伸用，說讓后來的BOD結(jié)合上去） 然后在進(jìn)行第一鏈cNDA合成，這時(shí)候才加BDO。 不知道以我的那種方法來做能不能達(dá)到同樣的效果。就在在反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候在5‘端加上BDO序列。 求助求助�。�！ |
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