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berry94鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
高GC含量目的基因的克隆 已有14人參與
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| 大家好，我要克隆一個(gè)1.2K的目的基因，GC含量70%，克隆了很長時(shí)間了，一直沒有什么進(jìn)展，特地來向前輩們求助。個(gè)人認(rèn)為RNA提取應(yīng)該是很好的，一直覺著反轉(zhuǎn)錄得不好，我用的promega A5000的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，48度、50度反轉(zhuǎn)過，都沒有擴(kuò)出條帶，做RACE也沒有得到結(jié)果，所以希望有經(jīng)驗(yàn)者提下意見，讓晚輩進(jìn)步！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
berry94: 金幣+3, ★★★很有幫助 2015-01-06 10:56:52
berry94: 回帖置頂 2015-01-06 10:57:02
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| 我做的基因就是GC含量很高的，如果你懷疑反轉(zhuǎn)錄有問題，你可以用一段小一點(diǎn)的比較好P的引物來試一下能不能P出來，我P的時(shí)候都會(huì)加DMSO幫助解鏈，然后我感覺引物的設(shè)計(jì)也很重要，個(gè)人體會(huì)，用的兩對(duì)引物，一對(duì)就怎么也p不出來，然后換了一對(duì)引物就很輕松的p出來了，用的GXL |
6樓2015-01-06 09:05:35
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【答案】應(yīng)助回帖
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GC含量那么高，而且又是1200bp的模板，普通酶應(yīng)該擴(kuò)增不出來，最好是使用專門用于長片段擴(kuò)增的酶，也不要盲目的只選擇高保真酶，畢竟高保真酶還是保真性居首位，不一定能對(duì)長片段的進(jìn)行擴(kuò)增啊。 對(duì)于高GC的模板，優(yōu)化是一定不能少的，如果你購買的試劑盒中有直接是供高GC擴(kuò)增的buffer的話，是最好的，這樣就不用額外進(jìn)行鎂離子、DMSO的優(yōu)化了，操作起來簡(jiǎn)單方便的，如果有熱啟動(dòng)又長片段擴(kuò)增的 最好不過了 （現(xiàn)在市場(chǎng)上極少極少的） 選酶是關(guān)鍵，buffer也是關(guān)鍵 希望有所幫助哦 |
19樓2015-01-08 11:51:37
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9樓2015-01-06 15:10:34
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