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Sunshine_WHL銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助Western大神，我的pSmad怎么跑出來(lái)是三條呢？？？藍(lán)瘦香菇==
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我做成骨方向，是裂解C2C12細(xì)胞，然后用Western Blot分析細(xì)胞內(nèi)pSmad1/5/8蛋白的含量。我計(jì)算了一下我跑膠的上樣量大約45ug，然后按我們實(shí)驗(yàn)室前輩們摸索出來(lái)的經(jīng)驗(yàn)，恒電壓80V至跑出條帶，然后換100V跑，整個(gè)過(guò)程大約90min。pSmad分子量大約在60kDa,我用的內(nèi)參GAPDH在36kDa，于是轉(zhuǎn)膜我用300mA轉(zhuǎn)70min，感覺(jué)轉(zhuǎn)的挺好的。接下來(lái)我用5%BSA室溫封閉3h，然后加入1:1000的一抗4度孵育過(guò)夜，第二天吸出一抗用TBST洗三遍，每次5min，然后加入1：1000二抗室溫孵育2h，然后用TBST洗三遍，每次5min，接下來(lái)就用ECL顯色劑顯色了，可是我跑了好幾次感覺(jué)都不一樣。。。 附件1是我上次跑的pSmad有一條，附件2是我這次跑的居然有3條。。。要哭了，有誰(shuí)可以解釋一下嗎？ 1.PNG 2.PNG |
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Sunshine_WHL
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