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jasonyuanjx

銅蟲 (初入文壇)

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[求助] western blot實(shí)驗(yàn)相關(guān)求助已有1人參與

本人跨方向做科研，屬于新手一枚，現(xiàn)在在學(xué)習(xí)WB實(shí)驗(yàn)技術(shù)，請教蟲友幾個問題，希望細(xì)心解答，好答案加金幣：
1，SDS-PAGE分離膠濃度的選擇：在實(shí)驗(yàn)室隨便找了幾個抗體，想先摸遍WB流程，熟悉方法技術(shù)，所以抗體隨意選擇（目前實(shí)驗(yàn)室有220，80，48，25分子量的蛋白抗體供選擇），內(nèi)參選的是GAPDH，通過查閱文獻(xiàn)GAPDH分子量是36，我選擇80的目的蛋白可以嗎？如果選48的會不會和內(nèi)參太近，影響結(jié)果觀察。如果選80的蛋白，選擇10%的分離膠好，還是12%的分離膠好？
2，分離膠濃度確定后，用多大的電壓，跑多場時間為宜？
3，轉(zhuǎn)膜條件怎么選擇？

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worktogethertoachieveourdreamandnevergiveup

1樓 2014-05-04 15:42:38

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

cedriclin

金蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

1.80的可以啊，可以與內(nèi)參切開，選用10%，12%的分離膠都可以；
2.濃縮電壓80-90V，分離電壓110-130V都可以，通常濃縮需要半小時左右marker才會分離，分離膠再跑1小時左右吧，這個不固定，因?yàn)槊總€實(shí)驗(yàn)室的儀器，電泳緩沖液什么的都有差別；
3.濕法轉(zhuǎn)膜，150mA恒流轉(zhuǎn)2個小時即可

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回復(fù)此樓

2樓2014-05-05 21:12:43