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yanshuai511銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
急！500kD 蛋白western 求助
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| 最近在做血漿中apoB的western，大小是520kD，濃縮膠5%，分離膠7% （150V，5h），感覺分的還可以，可轉(zhuǎn)膜（350mA，5h）老是有問題。壓出來的條帶也不是很好看。有沒有人做過的，求指導(dǎo)一下？ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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yanshuai511: 金幣+10, ★有幫助 2013-09-08 13:52:36
myprayer: 金幣+3, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-10 10:48:21
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樓主說的如果是轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到膜上的效率低，那么可以有如下解決方法（濕轉(zhuǎn)）： 1.轉(zhuǎn)移緩沖溶液中加入終濃度為20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但是增加蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合能力；甲醇可以防止凝膠變形；甲醇對于高分子蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間。 2.轉(zhuǎn)移緩沖溶液中加入終濃度為0.1%的SDS，理由在8樓我已經(jīng)說過了。 3.使用小孔徑的NC膜，孔徑0.2um的膜。 4.使用戊二醛交聯(lián)蛋白質(zhì)。上樣后可以用戊二醛交聯(lián)膜上的蛋白質(zhì)，這樣蛋白質(zhì)自身構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)與NC膜的纖維網(wǎng)絡(luò)會彼此交叉構(gòu)成約束，使得NC膜上的蛋白質(zhì)不易被洗下來。 5.對于大分子量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜時電壓要高一點，一般 恒壓100V，限流400mA，時間也要延長一點，比3小時要長，開始最好也用兩塊膜，注意加強降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來降溫。 6.適當增加轉(zhuǎn)膜時間。 |
13樓2013-09-06 22:16:42
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| 對于大分子量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜時電壓要高一點，一般 恒壓100V，限流400mA，時間也要延長一點，比3小時要長，開始最好也用兩塊膜，注意加強降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來降溫。轉(zhuǎn)膜實際上就是讓蛋白質(zhì)進入硝纖膜的纖維分子之間的空隙，所以蛋白質(zhì)變成線狀比較容易滲入到硝纖膜的纖維分子之間，因為空間位阻小，且不容易在掉下來，所以在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入矢量濃度的SDS（可配置為：1L轉(zhuǎn)膜緩沖液含0.37gSDS，這個濃度不可讓蛋白質(zhì)完全變?yōu)榫�狀，不然會影響后面的免疫識別）使得蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象變?yōu)榫�形比較容易操作成功。熱變性的蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象不是完全線形的，其中還存在很多的二級結(jié)構(gòu)，盡管并非天然二級結(jié)構(gòu)，但是仍然對于蛋白質(zhì)進入硝纖膜的纖維分子之間的空隙會構(gòu)成位阻效應(yīng)，在大分子量的蛋白質(zhì)中的熱變性的非天然二級結(jié)構(gòu)更多，所以位阻效應(yīng)在轉(zhuǎn)膜時更加明顯。至于免疫反應(yīng)那一步，抗體識別抗原的免疫決定簇有空間免疫決定簇也有序列免疫決定簇，一般只要不是蛋白質(zhì)完全變?yōu)榫�形且無序列免疫決定簇，就不會沒有免疫識別的現(xiàn)象出現(xiàn)。 |
8樓2013-09-05 11:27:07
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