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yanshuai511銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
急！500kD 蛋白western 求助
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| 最近在做血漿中apoB的western，大小是520kD，濃縮膠5%，分離膠7% （150V，5h），感覺分的還可以，可轉膜（350mA，5h）老是有問題。壓出來的條帶也不是很好看。有沒有人做過的，求指導一下？ |
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 蛋白質生物學實驗經(jīng)驗 |
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yanshuai511: 金幣+10, ★有幫助 2013-09-08 13:52:36
myprayer: 金幣+3, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-10 10:48:21
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樓主說的如果是轉移蛋白質到膜上的效率低，那么可以有如下解決方法（濕轉）： 1.轉移緩沖溶液中加入終濃度為20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白質洗脫效率，但是增加蛋白質與NC膜的結合能力；甲醇可以防止凝膠變形；甲醇對于高分子蛋白質可延長轉移時間。 2.轉移緩沖溶液中加入終濃度為0.1%的SDS，理由在8樓我已經(jīng)說過了。 3.使用小孔徑的NC膜，孔徑0.2um的膜。 4.使用戊二醛交聯(lián)蛋白質。上樣后可以用戊二醛交聯(lián)膜上的蛋白質，這樣蛋白質自身構成的網(wǎng)絡與NC膜的纖維網(wǎng)絡會彼此交叉構成約束，使得NC膜上的蛋白質不易被洗下來。 5.對于大分子量的蛋白質，轉膜時電壓要高一點，一般 恒壓100V，限流400mA，時間也要延長一點，比3小時要長，開始最好也用兩塊膜，注意加強降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來降溫。 6.適當增加轉膜時間。 |
13樓2013-09-06 22:16:42
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| 對于大分子量的蛋白質，轉膜時電壓要高一點，一般 恒壓100V，限流400mA，時間也要延長一點，比3小時要長，開始最好也用兩塊膜，注意加強降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來降溫。轉膜實際上就是讓蛋白質進入硝纖膜的纖維分子之間的空隙，所以蛋白質變成線狀比較容易滲入到硝纖膜的纖維分子之間，因為空間位阻小，且不容易在掉下來，所以在轉膜緩沖液中加入矢量濃度的SDS（可配置為：1L轉膜緩沖液含0.37gSDS，這個濃度不可讓蛋白質完全變?yōu)榫�狀，不然會影響后面的免疫識別）使得蛋白質的空間構象變?yōu)榫�形比較容易操作成功。熱變性的蛋白質的空間構象不是完全線形的，其中還存在很多的二級結構，盡管并非天然二級結構，但是仍然對于蛋白質進入硝纖膜的纖維分子之間的空隙會構成位阻效應，在大分子量的蛋白質中的熱變性的非天然二級結構更多，所以位阻效應在轉膜時更加明顯。至于免疫反應那一步，抗體識別抗原的免疫決定簇有空間免疫決定簇也有序列免疫決定簇，一般只要不是蛋白質完全變?yōu)榫�形且無序列免疫決定簇，就不會沒有免疫識別的現(xiàn)象出現(xiàn)。 |
8樓2013-09-05 11:27:07
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