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雪之汐若銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
長(zhǎng)片段PCR問(wèn)題 已有4人參與
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要從斑馬魚(yú)基因組DNA上擴(kuò)增一個(gè)大約6K左右的片段 嘗試了實(shí)驗(yàn)室所有的酶，Taq，KOD，KODneo……但是直接擴(kuò)增均失敗 有了一個(gè)新的思路，把6K分成3個(gè)2K 的片段，用Overlap PCR最后連接在一起，但是小片段擴(kuò)增成功，測(cè)序也是正確的，沒(méi)有辦法用Overlap PCR的方式融合在一起，不知道是出了啥狀況，大家都有啥好的建議。 或者說(shuō)有沒(méi)有相關(guān)從基因組上擴(kuò)增長(zhǎng)片段的經(jīng)驗(yàn)，好用的酶或者Kit之類(lèi)的，感激不盡，祝大家科研天天出成果@biostar2009@飛約瘋?cè)嗽?/u>@wizardfan@youlinglyw |
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雪之汐若
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7樓2016-09-05 21:33:09
zhangyunjing
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9樓2016-09-06 16:31:27
雪之汐若
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11樓2016-09-06 17:58:22
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16樓2016-09-07 14:15:10
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2樓2016-09-05 17:26:20
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你做overlap PCR兩個(gè)兩個(gè)分開(kāi)做的嗎？還是三個(gè)一起？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
3樓2016-09-05 19:01:17
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6k應(yīng)該是可以pcr的，如果是直接pcr可以嘗試第一步的預(yù)變形時(shí)間延長(zhǎng)到15min，酶可以試試NEB的Q5聚合酶。如果是直接分段pcr然后overlap pcr，實(shí)際上是不太容易連接的，可以試試其他連接手段，比如一步克隆。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
4樓2016-09-05 19:08:40
5樓2016-09-05 19:47:42
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6樓2016-09-05 21:32:42
cry_2013
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8樓2016-09-06 13:38:23
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10樓2016-09-06 17:58:11
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