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木子林夕lms

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[交流] 畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)問(wèn)題

前期我用Pme I酶線性化pPICZaA載體后進(jìn)行電轉(zhuǎn)SMD1168酵母菌株，挑單菌落，經(jīng)特異性引物與通用引物驗(yàn)證后均為陽(yáng)性克隆子。在YPD活化后轉(zhuǎn)接到50ml BMGY中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)3.0時(shí)進(jìn)行菌體沉淀，移入100ml BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)。但是誘導(dǎo)好幾次都沒(méi)有表達(dá)出蛋白。后面重新?lián)Q了線性化位點(diǎn)（Sac I)，再一次構(gòu)建酵母表達(dá)菌株，驗(yàn)證后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，還是表達(dá)不出蛋白。請(qǐng)教各位做酵母表達(dá)的前輩，幫忙分析下有可能是什么原因造成的呢？

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1樓 2016-09-30 11:50:54

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12gxtang

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引用回帖:

22樓: Originally posted by 微微皮蛋 at 2018-01-25 21:29:33
樓主，問(wèn)題解決了嗎，我的也是pcr全是陽(yáng)性，一表達(dá)就不行

除非提取酵母基因組進(jìn)行PCR，直接菌落PCR我個(gè)人感覺(jué)不是很穩(wěn)定，有時(shí)候有陽(yáng)性，有時(shí)候沒(méi)有。目的蛋白是EGFP，菌落PCR時(shí)有時(shí)無(wú)，但是都可以觀察到熒光。

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25樓2018-10-19 10:58:33

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ttszero

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木子林夕lms(金幣+1): 謝謝參與

我在ypds平板上活化，酵母比原核麻煩多了，plasmid電轉(zhuǎn)要與基因組重合，不然表達(dá)不出來(lái)，還要看下酵母本身是否對(duì)甲醇敏感的

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4樓2016-10-02 18:14:49

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我也在做蛋白表達(dá)，同樣也是表達(dá)不出來(lái)，感覺(jué)好痛苦，也希望請(qǐng)教廣大蟲(chóng)友

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7樓2016-10-07 12:01:14

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肖穎2009

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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-10-10 22:42:47

1、確定你要表達(dá)的蛋白可以在酵母中表達(dá)，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道沒(méi)有？
2、你的質(zhì)粒線性化后有沒(méi)有電泳檢測(cè)線性化的效果？
3、轉(zhuǎn)化后你是直接表達(dá)沒(méi)有篩選嗎？我看你都是直接放大的100ml，可以一次多挑幾株菌做小量表達(dá)，有表達(dá)了再放大。

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8樓2016-10-08 15:36:58

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