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Anson1358鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[交流]
【求助/交流】MBP融合蛋白活性低？ 已有5人參與
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我在用MBP tag表達(dá)蛋白，親和純化后得到的融合蛋白，測(cè)定活性。發(fā)現(xiàn)活性很低，用factor Xa酶切，切完之后跑電泳發(fā)現(xiàn)有MBP，目的蛋白卻不見(jiàn)了，是怎么回事？小弟都要愁死啦，實(shí)驗(yàn)做不出來(lái)沒(méi)法畢業(yè)��！敬請(qǐng)各位高人指點(diǎn)！ 大家都是怎么做的？ |
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9樓2014-01-26 23:30:01
Anson1358
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2樓2010-04-24 09:12:10
goodwish
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Anson1358(金幣+6): 2010-04-24 17:51
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使用MBP tag有一個(gè)問(wèn)題，就是MBP表達(dá)效率太高，拖著后面的蛋白快速表達(dá)，而導(dǎo)致你的目的蛋白沒(méi)有折疊好。 用蛋白酶切完后跑電泳，染膠的時(shí)候不要去掉濃縮膠，染完后注意看一下濃縮膠和分離膠之間是不是有一條帶。如果有，那證明你的蛋白沒(méi)有折疊好，切除前面的tag后聚集在一起形成大的復(fù)合體，跑不進(jìn)分離膠。 如果出現(xiàn)這種情況，那你可以嘗試在親和純化之后先過(guò)一個(gè)分子篩，看一下融合蛋白有沒(méi)有聚集，把沒(méi)有聚集的部分回收再用蛋白酶切。 如果依然聚集，那沒(méi)辦法了，換載體吧。 |
3樓2010-04-24 10:56:58
Anson1358
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4樓2010-04-25 10:27:05
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