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[交流]
【求助/交流】連接表達(dá)載體PET-28A失敗原因 已有14人參與
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| 大家好，我構(gòu)建表達(dá)載體連接PET-28A，已經(jīng)連接多次但都失敗，感受態(tài)細(xì)胞也換了幾次，鑒定全是假陽(yáng)性，這可能是什么原因呢，希望大家多多幫忙！ |
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chemifunan
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+1):歡迎多多交流~~ 2010-05-08 18:42:15
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lstt09nk(金幣+1):歡迎多多交流~~ 2010-05-08 18:42:15
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片段切好了就不會(huì)有問(wèn)題 載體要好好切切 pET28a拷貝數(shù)很低 載體抽質(zhì)粒時(shí)抽濃一些 切好一批量大的放著每次取個(gè)半微升以后省事 告訴我酶切位點(diǎn) 28a很大 5.5k克隆幾百bp 會(huì)不會(huì)你鑒定的時(shí)候切下來(lái)的小片段太稀了沒(méi)看見(jiàn)啊 倒個(gè)1.2%的膠 構(gòu)建好以后抽濃點(diǎn)切 酶要過(guò)量 溫育3h以上 跑膠再看 酶切鑒定 TAE就不用了 看不出什么來(lái) 直接抽提 kana用50就行 用普通的克隆菌 不要用BL21 等確定對(duì)了純了再轉(zhuǎn)BL21 你直接連接測(cè)序怎么辦？ pET通用引物有的 但是中國(guó)很多公司給的不對(duì) 你在哪個(gè)城市 上海這邊不行 我一般PCR產(chǎn)物測(cè)完了對(duì)了再連 |
8樓2010-05-08 16:32:15
fungixx
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2樓2010-05-08 14:44:43
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yujiaping1
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lstt09nk(金幣+1):歡迎多多交流~~ 2010-05-08 18:50:34
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lstt09nk(金幣+1):歡迎多多交流~~ 2010-05-08 18:50:34
| 你用的是藍(lán)白篩選嗎？如果是藍(lán)白篩選，那么選的白斑就絕對(duì)不是空載，而是連接的片段太小，你沒(méi)有看到而已，所以我有可能是質(zhì)粒污染。但是污染也不可能沒(méi)有陽(yáng)性，那你沒(méi)有陽(yáng)性，很有可能還是連接的問(wèn)題，沒(méi)有連上是最大的原因。你連接的片段是PCR產(chǎn)物，還是膠回收產(chǎn)物，還是其他什么片段，濃度怎么樣，長(zhǎng)度多大 |
4樓2010-05-08 15:22:25
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