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zhangwuhui銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】基因克隆實(shí)驗(yàn)為非目的片段？ 已有16人參與
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克隆實(shí)驗(yàn)問(wèn)題 1、以cDNA為模板做PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物和預(yù)期的長(zhǎng)度一樣。 2、再用pMD-19載體連接目的片段，之后液體LB（含氨芐）200轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)，取300微升倒在LB平板培養(yǎng)24小時(shí)左右，以陽(yáng)性菌落長(zhǎng)到直徑1-2毫米為止；再挑3-5個(gè)陽(yáng)性單克隆放大培養(yǎng)24小時(shí)左右。 3、裂解菌體，4°C ，12 000 g ，離心20-30分鐘，得到質(zhì)粒。 4、PCR檢測(cè)所得質(zhì)粒（引物為M13-47, RV-M），得到了目的片段大小的產(chǎn)物（稍長(zhǎng)些）。 5、送質(zhì)粒測(cè)序（使用通用引物M13-47），但是測(cè)序結(jié)果卻是如下其概況：在載體插入點(diǎn)之間的序列BLAST后，顯示為桿菌等細(xì)菌的片段，共送了10個(gè)樣品均是如此（本實(shí)驗(yàn)應(yīng)該是動(dòng)物的序列），看來(lái)不是空載，難道是載體連接上了細(xì)菌的一段序列，為什么會(huì)插入細(xì)菌片段呢，而且長(zhǎng)度就這么巧！還是其他什么原因呢，懇請(qǐng)賜教！ [ Last edited by zhangwuhui on 2010-7-29 at 18:31 ] |
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stephenreal
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別忘了對(duì)照
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
reasonspare(金幣+2):謝謝分享。 2010-08-03 05:50:12
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
reasonspare(金幣+2):謝謝分享。 2010-08-03 05:50:12
| 千萬(wàn)別圖省事，在轉(zhuǎn)化時(shí)按照分子克隆的要求，加上載體對(duì)照、陰性對(duì)照（以LB或者SOB代替克隆基因）或無(wú)關(guān)對(duì)照（其它基因片段），這樣應(yīng)該能查出原因。而一般人做的時(shí)候，就只轉(zhuǎn)1個(gè)陽(yáng)性的。與其碰運(yùn)氣，還不如嚴(yán)格一點(diǎn)。如果載體對(duì)照甚或陰性對(duì)照也出現(xiàn)你描述的現(xiàn)象，才可以說(shuō)是污染，不要亂猜，反而費(fèi)時(shí)間。 |
7樓2010-07-27 11:11:14
sunyongle1
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2樓2010-07-25 21:02:34
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3樓2010-07-25 23:03:21
yujiaping1
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4樓2010-07-25 23:28:53
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