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zhangwuhui銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】基因克隆實(shí)驗為非目的片段？ 已有16人參與
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克隆實(shí)驗問題 1、以cDNA為模板做PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物和預(yù)期的長度一樣。 2、再用pMD-19載體連接目的片段，之后液體LB（含氨芐）200轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)1-2小時，取300微升倒在LB平板培養(yǎng)24小時左右，以陽性菌落長到直徑1-2毫米為止；再挑3-5個陽性單克隆放大培養(yǎng)24小時左右。 3、裂解菌體，4°C ，12 000 g ，離心20-30分鐘，得到質(zhì)粒。 4、PCR檢測所得質(zhì)粒（引物為M13-47, RV-M），得到了目的片段大小的產(chǎn)物（稍長些）。 5、送質(zhì)粒測序（使用通用引物M13-47），但是測序結(jié)果卻是如下其概況：在載體插入點(diǎn)之間的序列BLAST后，顯示為桿菌等細(xì)菌的片段，共送了10個樣品均是如此（本實(shí)驗應(yīng)該是動物的序列），看來不是空載，難道是載體連接上了細(xì)菌的一段序列，為什么會插入細(xì)菌片段呢，而且長度就這么巧！還是其他什么原因呢，懇請賜教！ [ Last edited by zhangwuhui on 2010-7-29 at 18:31 ] |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
reasonspare(金幣+2):謝謝分享。 2010-08-03 05:50:12
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| 千萬別圖省事，在轉(zhuǎn)化時按照分子克隆的要求，加上載體對照、陰性對照（以LB或者SOB代替克隆基因）或無關(guān)對照（其它基因片段），這樣應(yīng)該能查出原因。而一般人做的時候，就只轉(zhuǎn)1個陽性的。與其碰運(yùn)氣，還不如嚴(yán)格一點(diǎn)。如果載體對照甚或陰性對照也出現(xiàn)你描述的現(xiàn)象，才可以說是污染，不要亂猜，反而費(fèi)時間。 |
7樓2010-07-27 11:11:14
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10樓2010-08-02 23:14:28
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