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6樓2010-10-11 17:09:11
silicare
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1949stone(金幣+5):獎(jiǎng)勵(lì) 哈哈 2010-10-12 14:56:01
1949stone(金幣+5):獎(jiǎng)勵(lì) 哈哈 2010-10-12 14:56:01
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感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，效率最高的是電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到10次方，普通的化學(xué)轉(zhuǎn)化只能達(dá)到8次方，一般自己做也就是6-7次方 ，而最簡(jiǎn)單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管即開(kāi)始轉(zhuǎn)化，但效率也最低，只能滿(mǎn)足環(huán)形質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（某些公司也有現(xiàn)成試劑盒）。要想又簡(jiǎn)單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，最好的莫過(guò)于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。 以下是一些制備感受態(tài)的注意事項(xiàng)： 1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑。 2、培養(yǎng)基的裝量。培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的能量代謝問(wèn)題，是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng)。厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培養(yǎng)基的pH值。這里講的pH值并非單指配制或滅菌后的pH值，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來(lái)說(shuō)，接種前的pH值在6.8-7.2。等菌搖好后，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培養(yǎng)后的OD值。其實(shí)這是一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后，菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6、0.8等等。同時(shí)，OD值大時(shí)菌體總量大，感受態(tài)絕對(duì)數(shù)量要大一點(diǎn)。因此需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。 5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí)，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。 6、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用，因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。 7、此外文獻(xiàn)報(bào)道，在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。 8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。 9、有報(bào)道說(shuō)感受態(tài)制備之后放置24h效率會(huì)更好。 10、凍存的感受態(tài)用一次拿一管，不要反復(fù)凍融。化凍之后立即使用，不要冰上放太久。 11、操作時(shí)可以輕彈輕甩，盡量避免用移液器吹吸。 [ Last edited by silicare on 2010-10-12 at 11:52 ] |
3樓2010-10-11 17:05:50
violet.zhou
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7樓2010-10-11 18:59:39
幺精
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
amisking(金幣+7):鼓勵(lì)新蟲(chóng)發(fā)帖交流！～ 2010-10-11 19:53:01
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
amisking(金幣+7):鼓勵(lì)新蟲(chóng)發(fā)帖交流！～ 2010-10-11 19:53:01
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我是做微生物環(huán)境科學(xué)方面的,感受態(tài)和轉(zhuǎn)化會(huì)常做,有幾點(diǎn)感受想和大家分享一下: 1.做感受態(tài)之前,DH-5a的板子最好活化一下,如果板子放的時(shí)間長(zhǎng),感受態(tài)不好. 2.CaCl2要提前遇冷. 3.做好的感受態(tài)在4度放24-48h,轉(zhuǎn)化效率會(huì)更高. 4.熱激時(shí)間要精確. 5.自己做的感受態(tài)斑長(zhǎng)得大,長(zhǎng)得快;買(mǎi)的感受態(tài)長(zhǎng)得時(shí)間需要稍長(zhǎng)一些,但不要超過(guò)20個(gè)小時(shí). 6.轉(zhuǎn)化前要檢測(cè)一下模板的量,我們平時(shí)做時(shí)就是跑個(gè)膠,和Marker的亮度比一下,大概估計(jì)一個(gè)值,再做轉(zhuǎn)化.像我們建文庫(kù),DNA割膠純化之后檢測(cè),如果能看見(jiàn)條帶一般建文庫(kù)都能成功. 一點(diǎn)小小的心得體會(huì),有不妥的地方,大家指正哦. |
8樓2010-10-11 19:09:57
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