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silicare榮譽版主 (文壇精英)
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【專題】------------------感受態(tài)、轉化專題------------------ 已有16人參與
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 關注感受態(tài)的同志注意啦為滿足大家對感受態(tài)相關實驗的理論需求，特開此專貼  請大家分享自己的經(jīng)驗、感受、protocol等等  一律重獎  本帖的目的：讓每一個人都能通過此貼實現(xiàn)自己的高效轉化夢！  |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
amisking(金幣+7):鼓勵新蟲發(fā)帖交流！～ 2010-10-11 19:53:01
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
amisking(金幣+7):鼓勵新蟲發(fā)帖交流！～ 2010-10-11 19:53:01
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我是做微生物環(huán)境科學方面的,感受態(tài)和轉化會常做,有幾點感受想和大家分享一下: 1.做感受態(tài)之前,DH-5a的板子最好活化一下,如果板子放的時間長,感受態(tài)不好. 2.CaCl2要提前遇冷. 3.做好的感受態(tài)在4度放24-48h,轉化效率會更高. 4.熱激時間要精確. 5.自己做的感受態(tài)斑長得大,長得快;買的感受態(tài)長得時間需要稍長一些,但不要超過20個小時. 6.轉化前要檢測一下模板的量,我們平時做時就是跑個膠,和Marker的亮度比一下,大概估計一個值,再做轉化.像我們建文庫,DNA割膠純化之后檢測,如果能看見條帶一般建文庫都能成功. 一點小小的心得體會,有不妥的地方,大家指正哦. |
8樓2010-10-11 19:09:57
silicare
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1949stone(金幣+5):獎勵 哈哈 2010-10-12 14:56:01
1949stone(金幣+5):獎勵 哈哈 2010-10-12 14:56:01
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感受態(tài)制備及轉化的方法很多，效率最高的是電轉化，可達到10次方，普通的化學轉化只能達到8次方，一般自己做也就是6-7次方 ，而最簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管即開始轉化，但效率也最低，只能滿足環(huán)形質粒的轉化（某些公司也有現(xiàn)成試劑盒）。要想又簡單，又能有較高的轉化效率，最好的莫過于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態(tài)的制備與轉化方法。 以下是一些制備感受態(tài)的注意事項： 1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態(tài)有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。 2、培養(yǎng)基的裝量。培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培養(yǎng)基的pH值。這里講的pH值并非單指配制或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2。等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培養(yǎng)后的OD值。其實這是一個非常重要的參數(shù)，只是當OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數(shù)生長已經(jīng)不太可能，因此很多指導方法上強調OD不得大于0.6、0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，感受態(tài)絕對數(shù)量要大一點。因此需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。 5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗證明，當培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時，該方法制得的感受態(tài)要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。 6、培養(yǎng)溫度。文獻及經(jīng)驗告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實用，因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻而得出的一個非常理想方法。 7、此外文獻報道，在保存感受態(tài)時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態(tài)的效率增加。 8、液氮速凍也會使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內。 9、有報道說感受態(tài)制備之后放置24h效率會更好。 10、凍存的感受態(tài)用一次拿一管，不要反復凍融�；瘍鲋罅⒓词褂茫灰戏盘�。 11、操作時可以輕彈輕甩，盡量避免用移液器吹吸。 [ Last edited by silicare on 2010-10-12 at 11:52 ] |
3樓2010-10-11 17:05:50
dhd997
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6樓2010-10-11 17:09:11
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