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zwdnet鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】做培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR，β-actin內(nèi)參出現(xiàn)兩個(gè)條帶，求原因。
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我進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR，按試劑盒說(shuō)明提取總RNA后，用一步法進(jìn)行RT-PCR，用內(nèi)參β-actin的引物進(jìn)行，產(chǎn)物長(zhǎng)度315bp，反應(yīng)條件為：50攝氏度30min,94攝氏度2min，94攝氏度30s，59攝氏度30s,72攝氏度1min(上述三步進(jìn)行30次），72攝氏度7分鐘，然后用產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果兩個(gè)樣本（是兩瓶細(xì)胞中分別提取的總RNA)在紫外儀下均看到兩個(gè)條帶（見(jiàn)照片）。請(qǐng)問(wèn)這是不是正常？ 另外我還有個(gè)問(wèn)題請(qǐng)教：做RT-PCR是不是只要像這樣條帶出來(lái)就行了？如果要定量，是不是一個(gè)培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞提出來(lái)的RNA只能算一個(gè)樣本？比如我有兩瓶細(xì)胞，一個(gè)做實(shí)驗(yàn)組加藥，一個(gè)做對(duì)照組不加，兩瓶細(xì)胞分別提取一份總RNA，然后各分成3份同時(shí)進(jìn)行RT-PCR，最后獲得6個(gè)電泳后的光度值（實(shí)驗(yàn)組3個(gè)，對(duì)照組3個(gè)），之后按實(shí)驗(yàn)組3個(gè)樣本，對(duì)照組3個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。這樣是不是可以？還是一定要實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)3瓶細(xì)胞，對(duì)照組養(yǎng)3瓶細(xì)胞，每瓶提取1份總RNA？ 我第一次做RT-PCR，不太懂，謝謝幫助！ /*-------------------------------------以下為2月18日新增的---------------------*/ 又做了一次，從提總RNA開(kāi)始，這次是正式實(shí)驗(yàn)，加了干預(yù)因素的，還分了時(shí)間段（上次只是走一遍整個(gè)過(guò)程）還是內(nèi)參有兩個(gè)條帶，這次我是連目的基因一塊兒做了，目的基因很好，但是內(nèi)參還是有兩個(gè)條帶。這次我一共做了18個(gè)泳道，截圖是其中4個(gè)，最左邊是Marker，不太清楚，接著兩條是目的基因，最右邊是β-actin內(nèi)參，還是有兩個(gè)條帶。我的問(wèn)題是如果是DNA污染，應(yīng)該是3個(gè)基因都有污染吧？我還有個(gè)問(wèn)題：像這樣的圖片能定量嗎？因?yàn)樗袝r(shí)間段的所有基因都有條帶，也就是說(shuō)沒(méi)有空的，我問(wèn)了實(shí)驗(yàn)室老師，實(shí)驗(yàn)室只能出這樣的圖片，出不了數(shù)據(jù)的。謝謝了。 [ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ] |
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