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[交流]
【求助/交流】做培養(yǎng)細胞的RT-PCR，β-actin內參出現(xiàn)兩個條帶，求原因。
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我進行培養(yǎng)細胞的RT-PCR，按試劑盒說明提取總RNA后，用一步法進行RT-PCR，用內參β-actin的引物進行，產物長度315bp，反應條件為：50攝氏度30min,94攝氏度2min，94攝氏度30s，59攝氏度30s,72攝氏度1min(上述三步進行30次），72攝氏度7分鐘，然后用產物進行電泳，結果兩個樣本（是兩瓶細胞中分別提取的總RNA)在紫外儀下均看到兩個條帶（見照片）。請問這是不是正常？ 另外我還有個問題請教：做RT-PCR是不是只要像這樣條帶出來就行了？如果要定量，是不是一個培養(yǎng)瓶里的細胞提出來的RNA只能算一個樣本？比如我有兩瓶細胞，一個做實驗組加藥，一個做對照組不加，兩瓶細胞分別提取一份總RNA，然后各分成3份同時進行RT-PCR，最后獲得6個電泳后的光度值（實驗組3個，對照組3個），之后按實驗組3個樣本，對照組3個樣本進行統(tǒng)計學分析。這樣是不是可以？還是一定要實驗組養(yǎng)3瓶細胞，對照組養(yǎng)3瓶細胞，每瓶提取1份總RNA？ 我第一次做RT-PCR，不太懂，謝謝幫助！ /*-------------------------------------以下為2月18日新增的---------------------*/ 又做了一次，從提總RNA開始，這次是正式實驗，加了干預因素的，還分了時間段（上次只是走一遍整個過程）還是內參有兩個條帶，這次我是連目的基因一塊兒做了，目的基因很好，但是內參還是有兩個條帶。這次我一共做了18個泳道，截圖是其中4個，最左邊是Marker，不太清楚，接著兩條是目的基因，最右邊是β-actin內參，還是有兩個條帶。我的問題是如果是DNA污染，應該是3個基因都有污染吧？我還有個問題：像這樣的圖片能定量嗎？因為所有時間段的所有基因都有條帶，也就是說沒有空的，我問了實驗室老師，實驗室只能出這樣的圖片，出不了數(shù)據的。謝謝了。 [ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ] |
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7樓2011-02-18 12:45:27
zwdnet(金幣+1): 對我?guī)椭艽�，非常感謝！ 2011-02-22 12:21:56
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樓主的引物多長？如果在20邊上徘徊的話估計是引物太短，特異性不夠，可以考慮設計到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他產物。另外可以增加退火溫度，提高特異性。 如果樓主要進行統(tǒng)計學分析，個人認為必須3份分開提RNA，不能一起提了再分開做，不然就相當于是只有一個樣本，重復3次而已。樓主要的是3個平行樣本。 另外，提醒下樓主，內參的作用是用于消除模板量的差異，但是PCR的循環(huán)數(shù)和模板達到一定量時，產物的總量會達到一個平臺，也就是說，模板加多加少，產物跑膠都會差不多的亮，這樣樓主就會認為各體系內加入的模板數(shù)量是一樣的（其實不可能一樣），于是內參來消除模板量差異就無法起作用，要減少循環(huán)數(shù)，以達到內參之間的亮度有差異。 |
8樓2011-02-19 09:36:19
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