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鐵蟲 (初入文壇)

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[交流] 【求助/交流】做培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR，β-actin內(nèi)參出現(xiàn)兩個條帶，求原因。

我進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR，按試劑盒說明提取總RNA后，用一步法進(jìn)行RT-PCR，用內(nèi)參β-actin的引物進(jìn)行，產(chǎn)物長度315bp，反應(yīng)條件為：50攝氏度30min,94攝氏度2min，94攝氏度30s，59攝氏度30s,72攝氏度1min(上述三步進(jìn)行30次），72攝氏度7分鐘，然后用產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果兩個樣本（是兩瓶細(xì)胞中分別提取的總RNA)在紫外儀下均看到兩個條帶（見照片）。請問這是不是正常？
另外我還有個問題請教：做RT-PCR是不是只要像這樣條帶出來就行了？如果要定量，是不是一個培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞提出來的RNA只能算一個樣本？比如我有兩瓶細(xì)胞，一個做實(shí)驗(yàn)組加藥，一個做對照組不加，兩瓶細(xì)胞分別提取一份總RNA，然后各分成3份同時進(jìn)行RT-PCR，最后獲得6個電泳后的光度值（實(shí)驗(yàn)組3個，對照組3個），之后按實(shí)驗(yàn)組3個樣本，對照組3個樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。這樣是不是可以？還是一定要實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)3瓶細(xì)胞，對照組養(yǎng)3瓶細(xì)胞，每瓶提取1份總RNA？
我第一次做RT-PCR，不太懂，謝謝幫助！

/*-------------------------------------以下為2月18日新增的---------------------*/
又做了一次，從提總RNA開始，這次是正式實(shí)驗(yàn)，加了干預(yù)因素的，還分了時間段（上次只是走一遍整個過程）還是內(nèi)參有兩個條帶，這次我是連目的基因一塊兒做了，目的基因很好，但是內(nèi)參還是有兩個條帶。這次我一共做了18個泳道，截圖是其中4個，最左邊是Marker，不太清楚，接著兩條是目的基因，最右邊是β-actin內(nèi)參，還是有兩個條帶。我的問題是如果是DNA污染，應(yīng)該是3個基因都有污染吧？我還有個問題：像這樣的圖片能定量嗎？因?yàn)樗袝r間段的所有基因都有條帶，也就是說沒有空的，我問了實(shí)驗(yàn)室老師，實(shí)驗(yàn)室只能出這樣的圖片，出不了數(shù)據(jù)的。謝謝了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ]

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1樓 2011-01-28 09:43:36

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lstt09nk: 建議樓主把把實(shí)驗(yàn)結(jié)果都弄到一起，都弄到一樓最好，這樣便于大家瀏覽 2011-02-18 20:00:11

謝謝斑竹建議，該樓挪到1樓了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:47 ]

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7樓2011-02-18 12:45:27

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rioarsenal

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★
amisking(金幣+1): 鼓勵發(fā)帖交流！ 2011-01-28 19:44:00

怎么沒有marker��？

這EB加的也太多了，膠都紅了。。

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2樓2011-01-28 16:28:38

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引用回帖:

Originally posted by rioarsenal at 2011-01-28 16:28:38:
怎么沒有marker啊？

這EB加的也太多了，膠都紅了。。

marker是最左邊那個，好像是100bp到400bp的，我是在電泳儀旁邊的紫外儀里用自己的數(shù)碼相機(jī)拍的，不是專門的拍電泳圖片的設(shè)備（當(dāng)時已經(jīng)六點(diǎn)多，管拍照的老師下班了），那個紫外儀只是給人觀察用的，前面有個小門，平時觀察時要關(guān)門的，為了拍照只能半開著，偏紅不知道是不是這個原因。謝謝。

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3樓2011-01-28 23:48:29

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三磷酸腺苷

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)

★
lstt09nk(金幣+1): 鼓勵交流 2011-02-18 19:57:45

不是引物特異性不好，就是提取的RNA有DNA污染

marker不清晰，沒法怎么判斷~~

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4樓2011-01-30 09:58:54

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