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鐵蟲 (初入文壇)

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[交流] 【求助/交流】做培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR，β-actin內(nèi)參出現(xiàn)兩個(gè)條帶，求原因。

我進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR，按試劑盒說明提取總RNA后，用一步法進(jìn)行RT-PCR，用內(nèi)參β-actin的引物進(jìn)行，產(chǎn)物長度315bp，反應(yīng)條件為：50攝氏度30min,94攝氏度2min，94攝氏度30s，59攝氏度30s,72攝氏度1min(上述三步進(jìn)行30次），72攝氏度7分鐘，然后用產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果兩個(gè)樣本（是兩瓶細(xì)胞中分別提取的總RNA)在紫外儀下均看到兩個(gè)條帶（見照片）。請問這是不是正常？
另外我還有個(gè)問題請教：做RT-PCR是不是只要像這樣條帶出來就行了？如果要定量，是不是一個(gè)培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞提出來的RNA只能算一個(gè)樣本？比如我有兩瓶細(xì)胞，一個(gè)做實(shí)驗(yàn)組加藥，一個(gè)做對照組不加，兩瓶細(xì)胞分別提取一份總RNA，然后各分成3份同時(shí)進(jìn)行RT-PCR，最后獲得6個(gè)電泳后的光度值（實(shí)驗(yàn)組3個(gè)，對照組3個(gè)），之后按實(shí)驗(yàn)組3個(gè)樣本，對照組3個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。這樣是不是可以？還是一定要實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)3瓶細(xì)胞，對照組養(yǎng)3瓶細(xì)胞，每瓶提取1份總RNA？
我第一次做RT-PCR，不太懂，謝謝幫助！

/*-------------------------------------以下為2月18日新增的---------------------*/
又做了一次，從提總RNA開始，這次是正式實(shí)驗(yàn)，加了干預(yù)因素的，還分了時(shí)間段（上次只是走一遍整個(gè)過程）還是內(nèi)參有兩個(gè)條帶，這次我是連目的基因一塊兒做了，目的基因很好，但是內(nèi)參還是有兩個(gè)條帶。這次我一共做了18個(gè)泳道，截圖是其中4個(gè)，最左邊是Marker，不太清楚，接著兩條是目的基因，最右邊是β-actin內(nèi)參，還是有兩個(gè)條帶。我的問題是如果是DNA污染，應(yīng)該是3個(gè)基因都有污染吧？我還有個(gè)問題：像這樣的圖片能定量嗎？因?yàn)樗袝r(shí)間段的所有基因都有條帶，也就是說沒有空的，我問了實(shí)驗(yàn)室老師，實(shí)驗(yàn)室只能出這樣的圖片，出不了數(shù)據(jù)的。謝謝了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ]

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1樓 2011-01-28 09:43:36

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rioarsenal

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amisking(金幣+1): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流！ 2011-01-28 19:44:00

怎么沒有marker��？

這EB加的也太多了，膠都紅了。。

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2樓2011-01-28 16:28:38

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引用回帖:

Originally posted by rioarsenal at 2011-01-28 16:28:38:
怎么沒有marker��？

這EB加的也太多了，膠都紅了。。

marker是最左邊那個(gè)，好像是100bp到400bp的，我是在電泳儀旁邊的紫外儀里用自己的數(shù)碼相機(jī)拍的，不是專門的拍電泳圖片的設(shè)備（當(dāng)時(shí)已經(jīng)六點(diǎn)多，管拍照的老師下班了），那個(gè)紫外儀只是給人觀察用的，前面有個(gè)小門，平時(shí)觀察時(shí)要關(guān)門的，為了拍照只能半開著，偏紅不知道是不是這個(gè)原因。謝謝。

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3樓2011-01-28 23:48:29

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lstt09nk(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-02-18 19:57:45

不是引物特異性不好，就是提取的RNA有DNA污染

marker不清晰，沒法怎么判斷~~

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4樓2011-01-30 09:58:54

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shaquila

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是不是有DNA污染～～

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5樓2011-01-30 11:05:15

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wuw579

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有可能是不同剪切形式 actin是含量很多的基因非常容易P出來引物設(shè)計(jì)不得當(dāng)都能P出來三四條呢你試試參考文獻(xiàn)的引物

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6樓2011-02-07 16:43:55

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lstt09nk: 建議樓主把把實(shí)驗(yàn)結(jié)果都弄到一起，都弄到一樓最好，這樣便于大家瀏覽 2011-02-18 20:00:11

謝謝斑竹建議，該樓挪到1樓了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:47 ]

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7樓2011-02-18 12:45:27

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阿修羅Axuro

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zwdnet(金幣+1): 對我?guī)椭艽�，非常感謝！ 2011-02-22 12:21:56

樓主的引物多長？如果在20邊上徘徊的話估計(jì)是引物太短，特異性不夠，可以考慮設(shè)計(jì)到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他產(chǎn)物。另外可以增加退火溫度，提高特異性。
如果樓主要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，個(gè)人認(rèn)為必須3份分開提RNA，不能一起提了再分開做，不然就相當(dāng)于是只有一個(gè)樣本，重復(fù)3次而已。樓主要的是3個(gè)平行樣本。
另外，提醒下樓主，內(nèi)參的作用是用于消除模板量的差異，但是PCR的循環(huán)數(shù)和模板達(dá)到一定量時(shí)，產(chǎn)物的總量會(huì)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，也就是說，模板加多加少，產(chǎn)物跑膠都會(huì)差不多的亮，這樣樓主就會(huì)認(rèn)為各體系內(nèi)加入的模板數(shù)量是一樣的（其實(shí)不可能一樣），于是內(nèi)參來消除模板量差異就無法起作用，要減少循環(huán)數(shù)，以達(dá)到內(nèi)參之間的亮度有差異。

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8樓2011-02-19 09:36:19

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張力民1598

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我覺得應(yīng)該用三瓶細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，還有出現(xiàn)兩條帶的原因可能是引物特異性不好或有DNA污染

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9樓2011-02-19 10:06:53

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引用回帖:

Originally posted by 阿修羅Axuro at 2011-02-19 01:36:19:
樓主的引物多長？如果在20邊上徘徊的話估計(jì)是引物太短，特異性不夠，可以考慮設(shè)計(jì)到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他產(chǎn)物。另外可以增加退火溫度，提高特異性。
...

多謝！引物長度就是18bp的19bp,3個(gè)基因差不多都是這樣。blast我在研一設(shè)計(jì)引物的時(shí)侯就做過了，這是截圖

如果我要定性，就是證明細(xì)胞里有這兩種基因表達(dá)，內(nèi)參是不是不重要？唉，沒辦法，6月份就畢業(yè)了，還要找工作。我學(xué)醫(yī)的，將來可不是靠科研吃飯。

我改改退火溫度(實(shí)驗(yàn)中為59攝氏度）和循環(huán)次數(shù)（實(shí)驗(yàn)中為30次）看看吧，謝謝幫助！

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-19 at 16:13 ]

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10樓2011-02-19 16:07:21

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阿修羅Axuro

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我說的BLAST是引物BLAST，你把兩條引物放進(jìn)去，BLAST后，可以給你分析出可能會(huì)PCR出哪些基因。恩，如果只是定性的話，內(nèi)參基本不重要，內(nèi)參是用于RT-PCR半定量時(shí)用的，我所說的循環(huán)數(shù)影響也只是在半定量時(shí)有用。
18 19的話PCR mRNA還是有點(diǎn)少，如果PCR質(zhì)粒的話 15都沒問題，但是mRNA中含的基因太多，18 19的話特異性有點(diǎn)低了建議23以上的話比較好，每多一個(gè)堿基理論上特異性提高四倍。

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11樓2011-02-19 17:21:38

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