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starfishfly銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
酶連之后如何檢測(cè)？
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電泳檢測(cè)的話，圖譜應(yīng)該是什么樣子的？ 因?yàn)槊高B之后做轉(zhuǎn)化一直長不出來，所以在電轉(zhuǎn)之前把酶連產(chǎn)物跑了電泳，電泳圖譜類似于酶切之后的圖譜。不是應(yīng)該是連在載體上了嗎？這個(gè)時(shí)候的質(zhì)粒載體是什么狀態(tài)呢？超螺旋，還是松弛閉環(huán)？ 我電轉(zhuǎn)時(shí)也電了 質(zhì)粒載體，當(dāng)時(shí)切完載體并沒有割膠回收，而是直接用來酶連了，這樣也不會(huì)一點(diǎn)都不長吧？我電的質(zhì)粒載體也沒有長。。。。 求解答啊��！~~！！  |
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roomofxw
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2樓2011-04-18 17:17:09
starfishfly
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3樓2011-04-18 17:25:17
【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金幣+1): 酶切產(chǎn)物沒有做割膠回收，但是有重沉，這樣的話也是不受離子的影響的吧。第一次轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化出來的，這次不知道怎么就是長不了了。條件是一樣的，只是用的限制性內(nèi)切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金幣+1): 酶切產(chǎn)物沒有做割膠回收，但是有重沉，這樣的話也是不受離子的影響的吧。第一次轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化出來的，這次不知道怎么就是長不了了。條件是一樣的，只是用的限制性內(nèi)切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
| 如果你的連接效率還可以的話，連接液跑電泳，應(yīng)該是三條帶，一個(gè)載體，一個(gè)目的片段，還有一個(gè)連接產(chǎn)物，前兩個(gè)是線性的，后面那個(gè)應(yīng)該是環(huán)狀的，至于是不是超螺旋就不知道了。你說酶切產(chǎn)物沒有回收直接連接，你用的是fermentas的通用buffer？如果不是的話，一定要回收。還有，你電轉(zhuǎn)質(zhì)粒都沒有出轉(zhuǎn)化子，就是轉(zhuǎn)化條件沒有摸好。先用質(zhì)粒摸索個(gè)最佳條件，因?yàn)檫B接效率再高也不如質(zhì)粒的濃度高，對(duì)吧？ |
4樓2011-04-18 17:38:01
roomofxw
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【答案】應(yīng)助回帖
starfishfly(金幣+4): 謝謝你~~~我連了之后沒有長 可能是電轉(zhuǎn)的時(shí)候某步有問題吧~~~ 2011-04-21 10:14:17
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沒做過，也見過直接跑電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物的…… 原因很簡單，轉(zhuǎn)化靈敏度比跑電泳高 理論上，只要連上幾個(gè)，平板上就會(huì)長，而電泳可不是隨便幾個(gè)就能看見的。 電泳能看見怎么也得1ng吧，算5000bp質(zhì)粒，也要0.0006pmol 1mol=6.02*10^24 再算轉(zhuǎn)化率 千分之一 差不多也得十萬個(gè)菌落，實(shí)際上沒有那么多 隨感一寫，漏斗百出，姑且一聽，歡迎指正 真有方法，萬望指教 |
5樓2011-04-18 17:53:19
空谷幽風(fēng)
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:23
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:23
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先按二樓說的做一下。關(guān)于你問的問題，解答如下： 1.按說連接完后跑膠應(yīng)該是質(zhì)粒條帶，但實(shí)際情況卻并不是這樣：首先你要知道連接效率并沒有你想的那么高，并非大部分片段都可以連到載體上去，再加上片段和載體的濃度本身就非常低，因此通過跑膠很難分辨出是否發(fā)生連接的 2.假設(shè)可以通過膠分辨出條帶，那么連接好的質(zhì)粒有兩種形態(tài)即超螺旋和開環(huán)，線性的條帶為片段和酶切過的質(zhì)粒 |
6樓2011-04-18 18:07:05
天使托
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T.Shen
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:33
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:33
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連接完之后你直接去點(diǎn)樣？這樣也會(huì)有條帶嗎？這個(gè)我還真沒有試過，不過你轉(zhuǎn)化之后，如果連接上的話，就會(huì)在菌體內(nèi)高拷貝的復(fù)制，這樣提取出來的質(zhì)粒量比較大，有利于電泳檢測(cè)。 一般為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒的話，可以利用菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如果有目的條帶然后再進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，然后再酶切驗(yàn)證，電泳驗(yàn)證； ps:電泳驗(yàn)證的時(shí)候可以點(diǎn)上你當(dāng)時(shí)酶切的質(zhì)粒和酶切的基因作為對(duì)照。 |
7樓2011-04-18 18:12:19
8樓2013-03-14 14:05:59
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