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starfishfly銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
酶連之后如何檢測？
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電泳檢測的話，圖譜應該是什么樣子的？ 因為酶連之后做轉(zhuǎn)化一直長不出來，所以在電轉(zhuǎn)之前把酶連產(chǎn)物跑了電泳，電泳圖譜類似于酶切之后的圖譜。不是應該是連在載體上了嗎？這個時候的質(zhì)粒載體是什么狀態(tài)呢？超螺旋，還是松弛閉環(huán)？ 我電轉(zhuǎn)時也電了 質(zhì)粒載體，當時切完載體并沒有割膠回收，而是直接用來酶連了，這樣也不會一點都不長吧？我電的質(zhì)粒載體也沒有長。。。。 求解答�。。~��！  |
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roomofxw
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2樓2011-04-18 17:17:09
starfishfly
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3樓2011-04-18 17:25:17
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金幣+1): 酶切產(chǎn)物沒有做割膠回收，但是有重沉，這樣的話也是不受離子的影響的吧。第一次轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化出來的，這次不知道怎么就是長不了了。條件是一樣的，只是用的限制性內(nèi)切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金幣+1): 酶切產(chǎn)物沒有做割膠回收，但是有重沉，這樣的話也是不受離子的影響的吧。第一次轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化出來的，這次不知道怎么就是長不了了。條件是一樣的，只是用的限制性內(nèi)切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
| 如果你的連接效率還可以的話，連接液跑電泳，應該是三條帶，一個載體，一個目的片段，還有一個連接產(chǎn)物，前兩個是線性的，后面那個應該是環(huán)狀的，至于是不是超螺旋就不知道了。你說酶切產(chǎn)物沒有回收直接連接，你用的是fermentas的通用buffer？如果不是的話，一定要回收。還有，你電轉(zhuǎn)質(zhì)粒都沒有出轉(zhuǎn)化子，就是轉(zhuǎn)化條件沒有摸好。先用質(zhì)粒摸索個最佳條件，因為連接效率再高也不如質(zhì)粒的濃度高，對吧？ |
4樓2011-04-18 17:38:01
roomofxw
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【答案】應助回帖
starfishfly(金幣+4): 謝謝你~~~我連了之后沒有長 可能是電轉(zhuǎn)的時候某步有問題吧~~~ 2011-04-21 10:14:17
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沒做過，也見過直接跑電泳檢測連接產(chǎn)物的…… 原因很簡單，轉(zhuǎn)化靈敏度比跑電泳高 理論上，只要連上幾個，平板上就會長，而電泳可不是隨便幾個就能看見的。 電泳能看見怎么也得1ng吧，算5000bp質(zhì)粒，也要0.0006pmol 1mol=6.02*10^24 再算轉(zhuǎn)化率 千分之一 差不多也得十萬個菌落，實際上沒有那么多 隨感一寫，漏斗百出，姑且一聽，歡迎指正 真有方法，萬望指教 |
5樓2011-04-18 17:53:19
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6樓2011-04-18 18:07:05
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7樓2011-04-18 18:12:19
8樓2013-03-14 14:05:59
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