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starfishfly銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
酶連之后如何檢測(cè)？
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電泳檢測(cè)的話，圖譜應(yīng)該是什么樣子的？ 因?yàn)槊高B之后做轉(zhuǎn)化一直長(zhǎng)不出來(lái)，所以在電轉(zhuǎn)之前把酶連產(chǎn)物跑了電泳，電泳圖譜類似于酶切之后的圖譜。不是應(yīng)該是連在載體上了嗎？這個(gè)時(shí)候的質(zhì)粒載體是什么狀態(tài)呢？超螺旋，還是松弛閉環(huán)？ 我電轉(zhuǎn)時(shí)也電了 質(zhì)粒載體，當(dāng)時(shí)切完載體并沒(méi)有割膠回收，而是直接用來(lái)酶連了，這樣也不會(huì)一點(diǎn)都不長(zhǎng)吧？我電的質(zhì)粒載體也沒(méi)有長(zhǎng)。。。。 求解答�。。~��！  |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:23
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:23
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先按二樓說(shuō)的做一下。關(guān)于你問(wèn)的問(wèn)題，解答如下： 1.按說(shuō)連接完后跑膠應(yīng)該是質(zhì)粒條帶，但實(shí)際情況卻并不是這樣：首先你要知道連接效率并沒(méi)有你想的那么高，并非大部分片段都可以連到載體上去，再加上片段和載體的濃度本身就非常低，因此通過(guò)跑膠很難分辨出是否發(fā)生連接的 2.假設(shè)可以通過(guò)膠分辨出條帶，那么連接好的質(zhì)粒有兩種形態(tài)即超螺旋和開(kāi)環(huán)，線性的條帶為片段和酶切過(guò)的質(zhì)粒 |
6樓2011-04-18 18:07:05
roomofxw
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2樓2011-04-18 17:17:09
starfishfly
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3樓2011-04-18 17:25:17
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金幣+1): 酶切產(chǎn)物沒(méi)有做割膠回收，但是有重沉，這樣的話也是不受離子的影響的吧。第一次轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化出來(lái)的，這次不知道怎么就是長(zhǎng)不了了。條件是一樣的，只是用的限制性內(nèi)切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:45:00
starfishfly(金幣+1): 酶切產(chǎn)物沒(méi)有做割膠回收，但是有重沉，這樣的話也是不受離子的影響的吧。第一次轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化出來(lái)的，這次不知道怎么就是長(zhǎng)不了了。條件是一樣的，只是用的限制性內(nèi)切酶不同。 2011-04-21 10:19:07
| 如果你的連接效率還可以的話，連接液跑電泳，應(yīng)該是三條帶，一個(gè)載體，一個(gè)目的片段，還有一個(gè)連接產(chǎn)物，前兩個(gè)是線性的，后面那個(gè)應(yīng)該是環(huán)狀的，至于是不是超螺旋就不知道了。你說(shuō)酶切產(chǎn)物沒(méi)有回收直接連接，你用的是fermentas的通用buffer？如果不是的話，一定要回收。還有，你電轉(zhuǎn)質(zhì)粒都沒(méi)有出轉(zhuǎn)化子，就是轉(zhuǎn)化條件沒(méi)有摸好。先用質(zhì)粒摸索個(gè)最佳條件，因?yàn)檫B接效率再高也不如質(zhì)粒的濃度高，對(duì)吧？ |
4樓2011-04-18 17:38:01
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