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leon198418029

金蟲 (小有名氣)

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[求助] TAQMAN探針定量PCR中的陰性樣品擴(kuò)增曲線問(wèn)題-2

這幾天看到蟲友們熱情討論我上一篇帖子的問(wèn)題，甚是高興，并且覺得有必要利用此機(jī)會(huì)和大家深入探討定量PCR的問(wèn)題。之前百度、谷歌得到的答案，沒(méi)有針對(duì)性。希望在此進(jìn)行的討論，能對(duì)你我他都有幫助。
我做定量PCR時(shí)，很多情況下，會(huì)遇到陰性對(duì)照在33個(gè)循環(huán)以后出現(xiàn)擴(kuò)增的情況，SYBR和TAQMAN都有，下面分開說(shuō)明。
SYBR法時(shí)，我對(duì)陰性對(duì)照溶解曲線分析后，其溶解溫度并沒(méi)有與模板退火溫度相差10度左右，僅3-5度。而且，陽(yáng)性樣品的溶解曲線分析沒(méi)有出現(xiàn)雙峰。百度之后，有種說(shuō)法是只要沒(méi)有出現(xiàn)雙峰，并且陰性對(duì)照單峰與陽(yáng)性樣品的單峰溫度相差不大，可以認(rèn)為不是引物二聚體，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是，這種情況到底是怎么造成的？并且隨機(jī)出現(xiàn)，而不是一直出現(xiàn)。有可能是污染，但也有可能是二聚體。之所以說(shuō)是二聚體，我認(rèn)為，也許是引物與模板結(jié)合能力大于引物之間的結(jié)合能力，所以在有模板的情況下，引物優(yōu)先與模板結(jié)合；而當(dāng)只有引物時(shí)，便形成二聚體。經(jīng)研究決定，既然陽(yáng)性樣品未出現(xiàn)雙峰，那么拋棄32個(gè)循環(huán)以后的樣品（陰性對(duì)照在33-34出現(xiàn)CT）。
TAQMAN法時(shí)，正如我上一篇帖子所示。因?yàn)橹皫熃阍谧鰰r(shí)，也經(jīng)常遇到這種情況，并且將陰性對(duì)照中的擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行PCR后，依舊是33個(gè)循環(huán)后起峰，而不是理論上早早的起峰（這是因?yàn)槿绻幮詷悠酚形廴�，那么高CT值便說(shuō)明其量極少。但是將其再進(jìn)行PCR時(shí)，上一輪的產(chǎn)物量作為模板已經(jīng)足量，便可較早產(chǎn)生CT）。通過(guò)研究與分析后決定，這種情況并非污染所致，但實(shí)在找不出原因。為了避免無(wú)用的重復(fù)和慎重起見，我們決定，拋棄30個(gè)循環(huán)之后的樣品，只保留前面。像這種處理方法，我曾經(jīng)在一次生命技術(shù)講座中見到過(guò)。他們的觀點(diǎn)是，有些時(shí)候，陰性擴(kuò)增出現(xiàn)CT的情況在所難免，為了保險(xiǎn)起見，可以將此CT-5個(gè)循環(huán)之前的樣品保留下來(lái)繼續(xù)研究，其余全部拋棄。
定量PCR屬于比較精密的生物研究方法，從準(zhǔn)備到上樣等等操作來(lái)不得半點(diǎn)閃失，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求嚴(yán)格。我認(rèn)為，如此費(fèi)心費(fèi)力的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行一次已很不容易，我們一定要盡量避免無(wú)謂的反復(fù)。另外，制備標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，每稀釋10倍便增加3.32個(gè)循環(huán)，而定量PCR的置信區(qū)間一般為8-30，有時(shí)可以到35。那么在大跨度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，往往低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品便會(huì)因?yàn)樯鲜鰡?wèn)題慘遭拋棄，造成實(shí)驗(yàn)失敗。因此，在此我們討論此類問(wèn)題以便找出對(duì)策，以避免將來(lái)同類問(wèn)題的出現(xiàn)，為定量PCR實(shí)驗(yàn)者帶去福音！
PS：有一個(gè)很重要的問(wèn)題，困擾了我很久：定量PCR的反應(yīng)步驟必須是固定的嗎？是不是至多可以改改退火溫度？循環(huán)次數(shù)能不能改？反應(yīng)時(shí)間呢？我用的是ABI 7500，默認(rèn)值一直都是40個(gè)循環(huán)。我想，既然上述問(wèn)題是在35起峰，那么干脆設(shè)置循環(huán)數(shù)為35不就行了？這樣做，無(wú)非是想做出一張好圖。如果審稿專家、答辯專家能理解咱們出現(xiàn)的問(wèn)題，還要這張好圖干嘛？對(duì)不對(duì)？

回復(fù)此樓

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