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hooroberts新蟲 (小有名氣)
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[求助]
gst標(biāo)簽，蛋白純化
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大家看看我這目的蛋白，在上清中純化有希望嗎，gst標(biāo)簽的，整了幾次沒出來，放好久了 ，如果不行的話是不是純化包涵體也行，gst的是不是變性后腰先復(fù)性再純化，如果復(fù)性的話怎么復(fù)性？做酶活的，對(duì)量不要求多大。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
hooroberts(金幣+8): 妹子威武��！哎，不過還是感覺希望不大，能直接用上清做陰性對(duì)照做酶活嗎? 2011-06-29 23:48:31
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
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1、上清純化當(dāng)然有希望了，GST標(biāo)簽特異性很好的，樓主不要嫌量少，純化時(shí)GST介質(zhì)不要裝太多，純化完后會(huì)有濃縮效果。 2、盡管GST是親水蛋白，融合以后這么大的分子量還想上清表達(dá)量大，基本不可能。 3、純化包涵體還是不推薦，GST標(biāo)簽的結(jié)合是和GST的構(gòu)象相關(guān)的，包涵體純化就肯定要做復(fù)性，而且你的復(fù)性條件既要保證GST的構(gòu)象回復(fù)正常（這點(diǎn)做不到標(biāo)簽不能用來純化），還要保證你的目的蛋白構(gòu)象回復(fù)正常（這點(diǎn)做不到你的蛋白沒活性）。 4、如果非要做包涵體，His標(biāo)簽優(yōu)于gst，你完全可以在變性條件（尿素中）下純化，純化完再做復(fù)性。 5、復(fù)性就是通過稀釋或透析把尿素等變性劑一次性或逐步除去，讓蛋白逐漸恢復(fù)天然構(gòu)象，以可溶狀態(tài)出現(xiàn)的過程，具體條件不同的蛋白是不一樣的，要自己去摸索。一般就是緩沖液啊，鹽濃度之類的。 |
5樓2011-06-29 20:08:12
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