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yaomoon新蟲 (小有名氣)
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[求助]
熒光定量PCR與普通PCR產(chǎn)物不一樣？
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我做熒光定量PCR,用Oligo6 設(shè)計(jì)的基因引物，擴(kuò)增片段長度為91bp, 擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值79.9。我先用普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃,5min; 94℃.30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s; 35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10min。擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳檢測后發(fā)現(xiàn)有200多bp并且只有一條帶（具體圖沒有拍下來）。但是我同樣的引物在熒光定量pcr儀上擴(kuò)增其溶解曲線的Tm值為79℃多一點(diǎn)，基本與我設(shè)計(jì)的一致。具體圖見附件。（其中熒光定量的擴(kuò)增條件與普通PCR不太一樣，我是采用的Takara試劑盒說明書上的兩步法）。請問這是怎么一回事？ 本人知道怎么發(fā)金幣，請版主代勞發(fā)給前20位回答問題的蟲友。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-24 19:28:10
yaomoon(金幣+3): 謝謝您的回帖，我會(huì)再進(jìn)行核對，并進(jìn)一步比較Q-PCR和普通PCR的電泳結(jié)果。 2011-07-25 20:39:55
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-24 19:28:10
yaomoon(金幣+3): 謝謝您的回帖，我會(huì)再進(jìn)行核對，并進(jìn)一步比較Q-PCR和普通PCR的電泳結(jié)果。 2011-07-25 20:39:55
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1.你設(shè)計(jì)的引物本來應(yīng)該擴(kuò)出91bp但你擴(kuò)的產(chǎn)物是200多bp，并且從你的溶解曲線圖上可以看出你設(shè)計(jì)的引物特異性非常好，所以請你確認(rèn)你的原始模板信息是否完全正確。 2.既然你做普通PCR和q-pcr用的引物及模板是完全一樣的，那么擴(kuò)增的片段是完全一樣的 |
2樓2011-07-24 10:06:58
cdl007
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3樓2011-07-24 10:49:23
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