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9k表達(dá)質(zhì)粒 電轉(zhuǎn)化km71
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大家好，我用的是pPIC9k表達(dá)質(zhì)粒 電轉(zhuǎn)化km71之后是涂什么平板篩選重組子呢，謝謝了, 我之前涂的是YPD+G418 ,看文獻(xiàn)怎么是MM之類 ，不知做何選擇 [ Last edited by qwky2010 on 2011-7-24 at 10:18 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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cdl007
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【答案】應(yīng)助回帖
qwky2010(金幣+10): 謝謝你，不過(guò)這個(gè)載體的說(shuō)明書上提供的是g418篩選的呀，我就不懂了，請(qǐng)指點(diǎn)，謝謝 2011-07-24 10:47:31
amisking: 2011-07-24 19:27:42
amisking: 2011-07-24 19:27:42
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http://blog.sina.com.cn/s/blog_6007f6d00100i0el.html 質(zhì)粒圖譜中并無(wú)neo抗性位點(diǎn)，用g418篩選沒(méi)用 可以用amp 藍(lán)白斑法篩選 或者用卡那霉素篩選 |
2樓2011-07-24 10:43:10
3樓2011-07-24 10:51:00
lxj341401
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【答案】應(yīng)助回帖
qwky2010(金幣+10): 謝謝啦 我見(jiàn)文獻(xiàn)有用MM平板篩選的，到底哪個(gè)好些呢 2011-07-24 10:59:32
amisking: 2011-07-24 19:27:48
amisking: 2011-07-24 19:27:48
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樓上說(shuō)的不完全正確！ pPIC9k轉(zhuǎn)大腸桿菌是用卡那霉素篩選，轉(zhuǎn)酵母就不能用卡那霉素篩選，只能用G418抗性篩選（原因是一個(gè)是原核生物一個(gè)是真核生物，有效的抗生素不一樣），，而且還可以用不同濃度G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。 電轉(zhuǎn)化之后篩選重組子用YPD+G418事可以的。 |
4樓2011-07-24 10:54:58
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5樓2011-07-24 10:56:18
6樓2011-07-24 11:01:18
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+6, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-24 19:27:59
amisking(金幣+6, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-24 19:27:59
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樓主沒(méi)說(shuō)用于真核或原核，。。 仔細(xì)查了一下 卡那能結(jié)合細(xì)菌核糖體的30S亞基上的16S rRNA，干擾formyl-methionyl-tRNA 與30SrRNA的連接，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)真核作用不大，真不到篩選的作用。 看宿主了，宿主是原核的用kana，是真核的話用G418 dxy上查了查，下面這個(gè)比較專業(yè)，一起學(xué)習(xí)之 一般卡那霉素抗性基因編碼的是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II，基因記做neo，能通過(guò)降解G418、新霉素和卡那霉素來(lái)實(shí)現(xiàn)真核和原核細(xì)胞的相應(yīng)抗性，這個(gè)酶在基因工程中是比較特殊的，既可以再原核生物中表達(dá)使大腸桿菌等表現(xiàn)出卡那霉素抗性，也可以再真核生物中表達(dá)使動(dòng)植物細(xì)胞表現(xiàn)出G418抗性。因?yàn)榭敲顾貙?duì)真核生物沒(méi)什么作用，所以一般應(yīng)用于原核生物就是卡那霉素抗性基因，應(yīng)用于真核生物就是G418抗性。如果需要在原核生物中應(yīng)用，必須要加上原核生物對(duì)應(yīng)宿主的啟動(dòng)子，為大腸桿菌設(shè)計(jì)的卡那抗性基因一般因啟動(dòng)子不通用，難以在革蘭氏陽(yáng)性菌和其他親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的宿主中表現(xiàn)出卡那霉素抗性。而如果需要在真核生物中使用，則必須加上相應(yīng)受體中能發(fā)揮作用的啟動(dòng)子，如需要在酵母中用G418篩選則需要加上酵母的啟動(dòng)子，如果需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用G418篩選則需要加上哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子等等。所以載體直接決定在目的細(xì)胞中是否能表達(dá)該基因，是否能表現(xiàn)相應(yīng)的抗性。當(dāng)然，真核生物中選擇G418，原核生物中選擇卡那霉素。 為原核生物表達(dá)所設(shè)計(jì)的表達(dá)載體如pET28a，其neo基因啟動(dòng)子只能在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中啟動(dòng)抗性基因的表達(dá)，是不能在真核生物中用于G418抗性篩選的。同樣，比如用于酵母表達(dá)的載體pPIC9K，攜帶一個(gè)氨芐抗性基因，同時(shí)攜帶的neo基因能在酵母中啟動(dòng)也能在大腸桿菌中啟動(dòng)，故可用于重組酵母G418篩選和大腸桿菌卡那霉素篩選，但同樣也不能用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的G418篩選。而pIRES2中只有一個(gè)neo抗性基因，但是既能在大腸桿菌中啟動(dòng)也能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中啟動(dòng)，故而可用于大腸桿菌卡那霉素抗性篩選和哺乳動(dòng)物細(xì)胞G418篩選，但是不能用于酵母等其他真核生物的G418抗性篩選。 |
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qwky20107樓2011-07-24 12:03:33
8樓2011-07-24 12:49:20
lxj341401
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9樓2011-07-24 14:52:05
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