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summer0702新蟲 (小有名氣)
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[求助]
淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法）中的幾個(gè)問題
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本人之前曾經(jīng)做過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，用的是自己配制的培養(yǎng)基，這次再做之后，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞始終無法被轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，原因無法找出，有知道原因者能否告之，不勝感激！具體實(shí)驗(yàn)步驟如下： 1.取18-22克小白鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整濃度為2*10的六次方，其它濃度也有做，但是也未能獲得成功。加入96孔板，每孔100ul,加入CONA或PHA 50ul，CON A終濃度分別為5,10,20ug/ML，PHA終濃度分別為10,20,40ug/ml.加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基50ul. 2.以加入100ul細(xì)胞懸液和100ul含10%小牛血清作為空白對(duì)照 3.96孔板分別加入100ul細(xì)胞懸液,50ul實(shí)驗(yàn)藥物溶液和50ul含10%小牛血清的1640. 4.于37度，5%CO2培養(yǎng)72小時(shí)，加入MTT（5mg/ml)20ul,培養(yǎng)4小時(shí)后進(jìn)行OD570測(cè)定。 淋巴細(xì)胞始終未能被轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，原因未能找到，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的問題，還是培養(yǎng)基的問題，還是刺激源的問題？哪位前輩能夠指點(diǎn)迷津，謝謝了！ |
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mafang68
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4樓2011-08-16 10:10:14
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
summer0702(金幣+3): 謝謝你的意見！分離時(shí)你也是用PBS的嗎？不是用Hank's?；有沒有遇到MTT不能被PBS溶解的問題！ 2011-08-16 10:04:46
lstt09nk(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-08-16 10:33:21
summer0702(金幣+2): 2011-09-17 16:11:35
summer0702(金幣+3): 謝謝你的意見！分離時(shí)你也是用PBS的嗎？不是用Hank's?；有沒有遇到MTT不能被PBS溶解的問題！ 2011-08-16 10:04:46
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summer0702(金幣+2): 2011-09-17 16:11:35
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我以前做過淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)，主要心得在于分離提取的細(xì)胞狀態(tài)好，試驗(yàn)就做的好。跟你交流一下經(jīng)驗(yàn)： 1.小鼠，我用的是C57，小白鼠主要是體液應(yīng)答為主 2.培養(yǎng)的血清，用的是10%胎牛的 3.分離細(xì)胞尤其要注意，快，快，再快！盡量減少細(xì)胞在外界的時(shí)間。分離時(shí)用的PBS也是加了血清的 4.還有一條最關(guān)鍵，培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的濃度，我做的沒有低于1*107，淋巴細(xì)胞小，多點(diǎn)沒關(guān)系 |
2樓2011-08-16 09:41:49
summer0702
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3樓2011-08-16 10:06:41
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5樓2011-08-16 10:14:35
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