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xiangquanju金蟲 (小有名氣)
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[求助]
做過用同源重組進行基因敲出的朋友請進，PCR做不出來！！
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利用同源重組的原理，打算敲掉大腸桿菌的一個基因，以pKD4為模板，打算擴增一段帶有卡那霉素抗性基因的片段，作為重組篩選的標(biāo)記。 上下游引物均有70bp，其中20bp是和質(zhì)粒模板互補的，其余50bp是和基因組上欲敲除的基因互補的。與質(zhì)粒互補的20bp，Tm值分別為47和60，PCR一直都只有引物帶，退火溫度從30--50度都試過了，也嘗試了pfu和KOD聚合酶，都沒什么改進 所以懇請做過類似實驗的蟲友指點指點 |
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9樓2011-11-24 11:18:43
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