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xiangquanju金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
做過(guò)用同源重組進(jìn)行基因敲出的朋友請(qǐng)進(jìn)，PCR做不出來(lái)�。�
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利用同源重組的原理，打算敲掉大腸桿菌的一個(gè)基因，以pKD4為模板，打算擴(kuò)增一段帶有卡那霉素抗性基因的片段，作為重組篩選的標(biāo)記。 上下游引物均有70bp，其中20bp是和質(zhì)粒模板互補(bǔ)的，其余50bp是和基因組上欲敲除的基因互補(bǔ)的。與質(zhì)�；パa(bǔ)的20bp，Tm值分別為47和60，PCR一直都只有引物帶，退火溫度從30--50度都試過(guò)了，也嘗試了pfu和KOD聚合酶，都沒(méi)什么改進(jìn) 所以懇請(qǐng)做過(guò)類似實(shí)驗(yàn)的蟲(chóng)友指點(diǎn)指點(diǎn) |
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xiangquanju
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謝謝，你的意思是在模板濃度上也應(yīng)該設(shè)置梯度么！！ 我之前也沒(méi)做過(guò)，本來(lái)想著是從質(zhì)粒上進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)該非常容易，結(jié)果都搗鼓了兩周了，都沒(méi)進(jìn)展 你能詳細(xì)給我說(shuō)一下么，比如說(shuō)一半用什么酶，模板濃度大概多少，其實(shí)我也有試過(guò)，質(zhì)粒不稀釋以及稀釋50倍來(lái)做模板，質(zhì)粒不稀釋，50ul全部電泳，能看到非常微弱的帶，我把條帶切下來(lái)做第二輪PCR的模板，結(jié)果沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái) |
4樓2011-11-21 19:40:04
2樓2011-11-21 02:48:41
zhqsun2006
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)積極應(yīng)助！ 2011-11-21 18:37:06
amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)積極應(yīng)助！ 2011-11-21 18:37:06
| 不知道你上下游片段與marker基因怎么連接的，如果是3個(gè)片段通過(guò)搭橋PCR連接的話，兩邊互補(bǔ)區(qū)域的退火溫度差別不要太大了，用pfu可以把延伸時(shí)間設(shè)長(zhǎng)點(diǎn)，我連接3個(gè)片段的時(shí)候2300bp延伸時(shí)間設(shè)了2min才把目的帶擴(kuò)出來(lái)，不好解釋的。如果是其他的方法，就再多問(wèn)問(wèn)查查吧。 |
3樓2011-11-21 11:43:12
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5樓2011-11-21 19:46:53
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