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syn1985木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
做過(guò)overlap PCR的蟲(chóng)子過(guò)來(lái)看看
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我準(zhǔn)備用in-frame deletion 做基因敲除 里面有一步是需要用overlap PCR擴(kuò)增片段用以構(gòu)建敲除質(zhì)粒 我看PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS (A. Beliaev, S.B. Reed, D. Stanek, D. Saffarini, M. Romine)里面介紹的時(shí)候說(shuō)overlap PCR的引物設(shè)計(jì)時(shí)需要加一個(gè)tag，就是擴(kuò)增的兩個(gè)片段有一塊是互補(bǔ)的，上面指寫(xiě)了要小于21bp，那這段序列應(yīng)該是自己在設(shè)計(jì)引物加上去的，可這段序列是自己隨便編一段，還是有設(shè)計(jì)依據(jù)的�。坷Щ笾�......  PS 我不需要在這段里面加入酶切位點(diǎn) 謝謝各位蟲(chóng)子 小女子在此謝過(guò) |
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blackrose8089
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syn1985
4樓2011-11-21 19:03:25
mytkkxx
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amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流。 2011-11-21 18:35:40
syn1985(金幣+20): 5 2011-11-21 21:37:54
wanhscn(金幣+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！補(bǔ)上EPI！ 2011-11-22 18:01:43
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wanhscn(金幣+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！補(bǔ)上EPI！ 2011-11-22 18:01:43
| 前不久做了下，這個(gè)不是隨便加的，如果要將兩個(gè)片段融合起來(lái)，那么在設(shè)計(jì)前面片段的反向引物的時(shí)候在5'端加上后面片段開(kāi)始的堿基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是說(shuō)中間兩個(gè)引物是反向互補(bǔ)的，40nt左右，也就是重疊PCR中重疊的部分 |
2樓2011-11-21 18:30:38
syn1985
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3樓2011-11-21 18:33:14
syn1985
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5樓2011-11-21 21:39:51
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